Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde
Summary
Cognate J-etki proteinleri hsp70 şaperon ile protein katlama bozulması arasında değişen biyolojik süreçler sayısız yardımcı olmak için işbirliği. Burada, bakteriyel, maya ve insan hücrelerinde geçici olarak oluşan bu şaperon makinelerinin izlenmesine olanak sağlayan bir in situ yakınlık ligasyon tetkikini tanımlıyoruz.
Abstract
J-etki proteinleri (JDP’ ler) ökaryotik hücrelerdeki en büyük ve en çeşitli eş-şaperon ailesini oluşturur. Son bulgular, JDP ailesinin belirli üyelerinin ökaryotlarda 70 kDa ısı şok proteini (Hsp70) şaperon bazlı protein disaggregazları için substrat seçiminde ince ayar yapmak için geçici heterokompleksler oluşturabileceğini göstermektedir. JDP kompleksleri akut/kronik strese bağlı toplu proteinleri hedef alır ve muhtemelen protein agregalarının yüzeyine birden fazla Hsp70’i işe alarak disagregaların biraraya getirilmesine yardımcı olur. Bu fiziksel olarak etkileşen JDP’ler tarafından oluşturulan protein kalite kontrol (PQC) ağının kapsamı in vivo olarak büyük ölçüde tanımlanmamış tır. Burada, ökaryotik hücrelerin farklı hücresel bölmelerinde bu geçici olarak oluşturulmuş şaperon komplekslerini sağlam bir şekilde yakalayabilen yakınlık ligasyon analizi (PLA) adlı yerinde protein etkileşimi testinde mikroskopi tabanlı bir tanım atıyoruz. Çalışmalarımız pla istihdamını insan hücrelerinden mayaya(Saccharomyces cerevisiae)ve bakterilere(Escherichia coli)genişletir ve böylece her ikisinde de geçici olarak oluşan protein derlemelerinin dinamiklerini izlemek için önemli bir araç oluşturur. prokaryotik ve ökaryotik hücreler.
Introduction
Hücresel etkileşimleri tam olarak anlamamız nedeniyle büyük miktarda genomik bilgi yorumlanabilir. Yaygın olarak kullanılmasına rağmen, kimyasal çapraz bağlantı ve protein ko-lokalizasyonu olmayan protein ko-immünopresidipitasyonu gibi geleneksel protein-protein etkileşim isaptama metodolojileri bir dizi dezavantaj teşkil eder. Bazı ana dezavantajları etkileşimleri kötü nicelleştirme ve olmayan yerli bağlayıcı olayların potansiyel giriş içerir. Buna karşılık, gelişmekte olan yakınlık tabanlı teknikler hücrelerde protein etkileşimleri yakalamak için bir alternatif ve güçlü bir yaklaşım sağlar. Yakınlık ligasyon test (PLA)1, şimdi özel bir kit olarak kullanılabilir, özellikle etkileşimalt birimlerinin yakınlığına dayalı protein kompleksleri hedef antikorlar kullanır.
PLA, hedeflenen protein kompleksinin yüzeyinde küçük DNA etiketleri (PLA probları) bulunan primer ve sekonder antikorlardan oluşan bir iskele nin oluşumu ile başlatılır (Şekil1, adım 1-3). Daha sonra, DNA etiketlerinin yakınlığı ile belirlenen dairesel bir DNA molekülü konektör oligonükleotidlerle melezleme yoluyla oluşturulur (Şekil1, adım 4). Dairesel DNA’nın oluşumu bir DNA ligasyon adımı ile tamamlanır. DNA’nın yeni oluşan dairesel parçası sonraki haddeleme daire amplifikasyon için bir şablon olarak hizmet vermektedir (RCA)tabanlı polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) konjuge oligonükleotid etiketleri biri tarafından astarlanmış. Bu, antikor iskelesi aracılığıyla protein kompleksine bağlı tek iplikli konkatemerik bir DNA molekülü oluşturur (Şekil1, adım 6). Concatemeric DNA molekülü, yükseltilmiş DNA’ya dağılmış birden fazla benzersiz diziyle melezleşen floresan etiketli oligonükleotidler kullanılarak görselleştirilmiştir (Şekil1, adım 7)2. Floresan nokta (Şekil1, adım 7) olarak görünen üretilen PLA sinyali, hedeflenen protein kompleksinin hücredeki konumuna karşılık gelir. Sonuç olarak, titretisi protein komplekslerini yüksek mekansal doğrulukla tespit edebilir. Teknik sadece protein etkileşimleri yakalama ile sınırlı değildir, ama aynı zamanda yüksek duyarlılık1,2ile proteinler üzerinde tek moleküller veya protein değişiklikleri tespit etmek için kullanılabilir .
Hsp70, bir dizi temizlik ve stresle ilişkili fonksiyonlara katılarak hücresel protein homeostazını korumak için temelde çok yönlü bir şaperon sistemi oluşturur. Hsp70 şaperon sisteminin temizlik faaliyetleri arasında de novo protein katlama, hücre zarları arasında protein translokasyonu, protein komplekslerinin biraraya toplanması ve disassemblyasyonu, protein aktivitesinin düzenlenmesi ve farklı protein katlamalarının bağlanması/ kalite kontrol makineleri3. Aynı şaperon sistemi aynı zamanda yanlış katlanmış/açılmamış proteinleri yeniden katar, protein agregasyonunu önler, protein ayrıştırmasını teşvik eder ve hücresel proteazlarla işbirliği ederek hücresel onarımı kolaylaştırmak için ölümcül olarak yanlış katlanmış/hasarlı proteinleri bozar. proteotoksik gerilmeler4,5. Bu işlevsel çeşitliliği elde etmek için, Hsp70 şaperon JDP ailesinin eş-şaperonları ve substrat bağlama veserbest3 Hsp70’s ATP bağımlı allosteric kontrolü ince ayar nükleotid değişim faktörleri (NEFs) ortaklık dayanır 6 . Ayrıca, JDP eş-şaperonlar bu çok yönlü şaperon sistemi için substrat seçiminde hayati bir rol oynamaktadır. Bu ailenin üyeleri prototip JDP, E. coli DnaJ kendi yapısal homoloji dayalı üç sınıf (A, B ve C) ayrılır. A sınıfı JDO’lar, Hsp70 ile etkileşime giren Bir N-terminal J-etki alanı, glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölge, Çinko parmak benzeri bir bölge (ZFLR) ve iki β-varil etki alanından oluşan bir substrat bağlama bölgesi ve bir C-terminal dimerizasyon etki alanı içerir. N-terminal J-etki alanı ve glisin-fenilalanin açısından zengin bir bölgeye sahip, ancak ZFLR’den yoksun JD’ler B sınıfına girerler. Genel olarak, bu iki sınıfın üyeleri refakat işlevlerinde yer almaktadır. Sadece J-etki alanı4paylaşmak JDPs içeren catchall sınıf C, altında düşen Üyeler, olmayan refakatsiz işlevleri çeşitli gerçekleştirmek için Hsp70s işe. JDP’lerin Hsp70 sisteminin değiştirilebilir substrat tanıma “adaptörleri” olarak önemli rolü, evrim sırasında aile üyelerinin genişlemesi ile yansıtılır. Örneğin, insanlar üzerinde 42 farklı JDP üyeleri4. Bu JDP’ler monomer, homodimer ve/veya homo/hetero oligomer4,5olarak işlev görür. Son zamanlarda, A sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJA2; S. cerevisiae Ydj1) ve B sınıfı (örneğin, H. sapiens DNAJB1; S. cerevisiae Sis1) ökaryotik JDPs in vitro agregaların verimli tanınmasını teşvik bildirilmiştir7,8. Bu karma sınıf JDP kompleksleri muhtemelen Hsp70 oluşumunu kolaylaştırmak için toplanan proteinlerin yüzeyinde biraraya- ve Hsp70 + Hsp100 tabanlı protein disaggregases7,8,9, 10. Ökaryotik hücrelerde geçici olarak oluşturulmuş bu karma sınıf JDP komplekslerinin varlığını destekleyen kritik kanıtlar PLA8ile sağlanmıştır.
PLA giderek metazoa protein etkileşimlerini değerlendirmek için istihdam edilmektedir, öncelikle memeli hücrelerinde. Burada, tomurcuklanan maya S. cerevisiae ve bakteri E. coli gibi ökaryotik ve prokaryotik tek hücreli organizmalarda geçici olarak oluşan şaperon komplekslerini izlemek için bu tekniğin başarılı bir şekilde genişlemesini rapor ediyoruz. Daha da önemlisi, bu genişleme pla’nın insan ve hayvan hücrelerini enfekte eden mikropların saptanması nda ve analizinde potansiyel kullanımını vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ko-immünoprepitasyon ve ko-lokalizasyon aparatlarına dayalı yaklaşımlar, protein birliğini karakterize etmek için uzun süreli yöntemler olarak kullanılmıştır. Geçici olarak oluşturulmuş özel şaperon komplekslerinin saptanması bu tür geleneksel yöntemlerle büyük bir sorundur ve sonuç olarak, önceki bulgular büyük ölçüde nitel yorumlamalarla sınırlıdır. Hücre lisis tabanlı koimmünopremteknikleri genellikle protein-protein etkileşimlerini stabilize etmek için çapraz bağlantı gerekti…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NBN Victoria Devlet Hükümeti ve Avustralya Hükümeti finansmanı ile Monash Üniversitesi Tıp Hemşireliği ve Sağlık Bilimleri Fakültesi özel bir İşe Hibe tarafından desteklenir. Bernd Bukau (ZMBH, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) ve Harm H. Kampinga’ya (Hücre ve Sistemler Biyomedikal Bilimler Bölümü, Groningen Üniversitesi, Hollanda) değerli destekleri ve reaktiflerin paylaşımı için teşekkür ederiz, Holger Lorenz (ZMBH) Görüntüleme Tesisi, Heidelberg Üniversitesi, Almanya) konfokal mikroskopi ve görüntü işleme ile destek için, ve Claire Hirst (ARMI, Monash Üniversitesi, Avustralya) el yazması eleştirel okuma için.
Materials
| 37% Formaldehyde | Merck | 103999 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 32201 | |
| anti-DNAJA2 antibody | Abcam | ab157216 | |
| anti-DNAJB1 Antibody | Enzo Life Sciences | ADI-SPA-450 | |
| anti-DnaK antibody | In house | ||
| anti-mCherry antibody | Abcam | ab125096 | |
| anti-Sis1 Antibody | Cosmo Bio Corp | COP-080051 | |
| anti-Ydj1 antibody | StressMarq Biosciences | SMC-150, | |
| anti-YFP antibody | In house | ||
| Coplin slide-staining jar | Sigma-Aldrich | S5516 | |
| Diagnostic slides | Marienfeld | 1216530 | |
| DMEM | Thermo-Fischer | 31966021 | |
| DuoLink In Situ Detection Reagents Orange | Sigma-Aldrich | DUO92007 | |
| DuoLink In Situ Mounting Medium + DAPI | Sigma-Aldrich | DUO82040 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Mouse MINUS | Sigma-Aldrich | DUO92004 | |
| DuoLink In Situ PLA Probe Anti-Rabbit PLUS | Sigma-Aldrich | DUO92002 | |
| DuoLink In Situ Wash Buffers, Fluorescence | Sigma-Aldrich | DUO82049 | |
| Fetal Calf Serum | Thermo-Fischer | 10082147 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | 62971 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 32213 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fischer | 15070063 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma-Aldrich | P47-07 | |
| Sorbitol | Sigma-Aldrich | S7547 | |
| Triton-X100 | Merck | 108643 | |
| Trypsin | Thermo-Fischer | 25300096 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Zymolase 100T / / Lyticase | United States Biological | Z1004 |
References
- Soderberg, O., et al. Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation. Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).
- Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Review of Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
- Mayer, M. P., Gierasch, L. M. Recent advances in the structural and mechanistic aspects of Hsp70 molecular chaperones. Journal of Biological Chemistry. 294 (6), 2085-2097 (2019).
- Kampinga, H. H., Craig, E. A. The HSP70 chaperone machinery: J proteins as drivers of functional specificity. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (8), 579-592 (2010).
- Nillegoda, N. B., Bukau, B. Metazoan Hsp70-based protein disaggregases: emergence and mechanisms. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Bracher, A., Verghese, J. The nucleotide exchange factors of Hsp70 molecular chaperones. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Crucial HSP70 co-chaperone complex unlocks metazoan protein disaggregation. Nature. 524 (7564), 247-251 (2015).
- Nillegoda, N. B., et al. Evolution of an intricate J-protein network driving protein disaggregation in eukaryotes. Elife. 6, (2017).
- Kirstein, J., et al. In vivo properties of the disaggregase function of J-proteins and Hsc70 in Caenorhabditis elegans stress and aging. Aging Cell. 16 (6), 1414-1424 (2017).
- Nillegoda, N. B., Wentink, A. S., Bukau, B. Protein Disaggregation in multicellular organisms. Trends in Biochemical Sciences. 43 (4), 285-300 (2018).
- Chae, C., Sharma, S., Hoskins, J. R., Wickner, S. CbpA, a DnaJ homolog, is a DnaK co-chaperone, and its activity is modulated by CbpM. Journal of Biological Chemistry. 279 (32), 33147-33153 (2004).
- Kityk, R., Kopp, J., Mayer, M. P. Molecular Mechanism of J-domain-Triggered ATP Hydrolysis by Hsp70 Chaperones. Molecular Cell. 69 (2), 227-237 (2018).
- Söderberg, O., et al. Characterizing proteins and their interactions in cells and tissues using the in situ proximity ligation assay. Methods. 45 (3), 227-232 (2008).
- Benschop, J. J., et al. A consensus of core protein complex compositions for Saccharomyces cerevisiae. Molecular Cell. 38 (6), 916-928 (2010).
- Jung, J., et al. Quantifying RNA-protein interactions in situ using modified-MTRIPs and proximity ligation. Nucleic Acids Research. 41 (1), (2013).
- Mocanu, M. M., Váradi, T., Szöllosi, J., Nagy, P. Comparative analysis of fluorescence resonance energy transfer (FRET) and proximity ligation assay (PLA). Proteomics. 11 (10), 2063-2070 (2011).
- Sekar, R. B., Periasamy, A. Fluorescence resonance energy transfer (FRET) microscopy imaging of live cell protein localizations. Journal of Cell Biology. 160 (5), 629-633 (2003).
- Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments. 87, (2014).
- Nagy, P., Szöllosi, J. Proximity or no proximity: that is the question – but the answer is more complex. Cytometry. 75 (10), 813-815 (2009).
- Hoetelmans, R. W., et al. Effects of acetone, methanol, or paraformaldehyde on cellular structure, visualized by reflection contrast microscopy and transmission and scanning electron microscopy. Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology. 9 (4), 346-351 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Stadler, C., Skogs, M., Brismar, H., Uhlen, M., Lundberg, E. A single fixation protocol for proteome-wide immunofluorescence localization studies. Journal of Proteomics. 73 (6), 1067-1078 (2010).
- Goldenthal, K. L., Hedman, K., Chen, J. W., August, J. T., Willingham, M. C. Postfixation detergent treatment for immunofluorescence suppresses localization of some integral membrane proteins. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33 (8), 813-820 (1985).
- Schrader, M., Almeida, M., Grille, S. Postfixation detergent treatment liberates the membrane modelling protein Pex11beta from peroxisomal membranes. Histochemistry & Cell Biology. 138 (3), 541-547 (2012).
- Willingham, M. C., Yamada, S. S., Pastan, I. Ultrastructural antibody localization of alpha2-macroglobulin in membrane-limited vesicles in cultured cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 75 (9), 4359-4363 (1978).
- Aguilar-Uscanga, B., Francois, J. M. A study of the yeast cell wall composition and structure in response to growth conditions and mode of cultivation. Letters in Applied Microbiology. 37 (3), 268-274 (2003).
- Romaniuk, J. A., Cegelski, L. Bacterial cell wall composition and the influence of antibiotics by cell-wall and whole-cell NMR. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 370, 1679 (2015).
- Salazar, O., Asenjo, J. A. Enzymatic lysis of microbial cells. Biotechnology Letters. 29 (7), 985-994 (2007).
- Cunningham, A. F., Spreadbury, C. L. Mycobacterial stationary phase induced by low oxygen tension: cell wall thickening and localization of the 16-kilodalton alpha-crystallin homolog. Journal of Bacteriology. 180 (4), 801-808 (1998).
- Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Microbiological Reviews. 57 (2), 383-401 (1993).
