Denne protokol skitserer etableringen af en musemodel til at studere Malassezia-Host interaktioner i huden. Det beskriver dyrkning af Malassezia in vitro, infektion af murine hud med Malassezia, og den efterfølgende analyse af inflammation og svampe byrden i hudvævet.
Dyremodeller er afgørende for forskning i infektionssygdomme. De udgør et vigtigt grundlag for at analysere det fulde spektrum af interaktioner, der opstår mellem mikrober og deres vært in vivo på en vævs specifik måde. Patogene svampe er i stigende grad anerkendt som en alvorlig trussel for mennesker og udnytte sådanne infektion modeller har i høj grad forbedret vores forståelse af svampe patogenicitet. Arter af slægten Malassezia er de mest rigelige svampe af den menneskelige hud mikrobiota og de er også forbundet med udviklingen af alvorlige inflammatoriske hudlidelser såsom seborrheic dermatitis og atopisk dermatitis. Men, en årsagssammenhæng mellem Malassezia og sygdoms patogenese forbliver ukendt, en kendsgerning, der kan tilskrives den ringe viden om den komplekse krydstale af Malassezia med hudens immunsystem. Denne protokol beskriver etableringen af en eksperimentel musemodel, der gør det muligt at studere samspillet mellem Malassezia og pattedyrs hud in vivo. Det skitserer metoden til dyrkning af Malassezia spp. under laboratorieforhold, hvordan man inficere murine hud med Malassezia spp. og hvordan man vurderer udfaldet af infektion ved hjælp af huden inflammation og svampe byrde analyser. Den model, der beskrives her, virker i fuldt immunkompetente dyr og er ikke afhængig af immunsuppressiv eller antibiotika forbehandling af dyrene. Det kan desuden tilpasses til stort set alle genetisk modificerede muse stammer, og det kombineres med andre hudsygdoms modeller. Disse funktioner gør denne infektion model et meget kraftfuldt værktøj til at studere i detaljer den medfødte og adaptive immunrespons af værten mod Malassezia i huden in vivo.
Huden er befolket af mange forskellige mikrober. Den konstante udsættelse af huden for mikrobiota bidrager til at forme og uddanne immunsystemet af værten. Svampe er i stigende grad anerkendt som en vital del af mikrobiota og de opfylder en vigtig rolle for vært fysiologi og immunitet, svarende til bakterier og vira1. Arter af slægten Malassezia er langt de mest rigelige svampe koloniserer huden af varmblodede hvirveldyr og de udgør mere end 90% af den menneskelige hud mycobiome2,3. Atten forskellige arter af Malassezia er hidtil blevet identificeret fra den menneskelige og animalske hud4.
Forskellige patologier af huden menes at opstå, i det mindste delvist, som følge af en dysbalanceret mikrobiota sammensætning. Dysbiosis kan føre til overvækst af arter med patogene potentiale resulterer i opportunistiske infektioner og sygdom5. Konsekvent, der er et stigende bevis for, at Malassezia, foruden sin kommensal livsstil, bidrager til udviklingen af forskellige hudpatologier, spænder fra skæl og pityriarsis versicolor til mere alvorlige inflammatoriske lidelser såsom som seborrheic dermatitis og atopisk dermatitis4,6. Mens en årsagssammenhæng mellem Malassezia og pityriarsis versicolor er blevet etableret, er den patofysiologiske rolle af svampen i mere alvorlige hudpatologier stort set ukendt.
Bestemmelse af rollen som Malassezia i huden homøostase og sygdom kræver mere dybtgående viden om samspillet mellem svampen med huden og det kutane immunsystem. Af note, forskning på Malassezia er, sammenlignet med andre humane svampe patogener (f. eks Candida albicans eller Aspergillus fumigatus), stadig i den spæde fase. Dette kan tilskrives vanskelighederne ved dyrkning af Malassezia under laboratorieforhold og manglen på egnede forsøgsmodeller til undersøgelse af svampen i kontakt med værten in vivo. Tidligere eksperimenter med isolerede celler i kulturen indikerede en bred vifte af direkte og indirekte interaktioner mellem Malassezia og forskellige immun-og ikke-immunceller7. Men disse in vitro eksperimenter kun delvist rekapitulere situationen i det komplekse hudmiljø in vivo, hvor talrige cellulære og molekylære hændelser optræder samtidig mellem svampen og forskellige celletyper.
Heri skitserer vi protokollen for en eksperimentel model af Malassezia hudinfektion i mus, som vi for nylig etablerede, for at studere svampen-Host interaktion i vivo7. Dette omfatter procedurer for (1) en vellykket dyrkning af Malassezia in vitro, (2) den epicutanholdige anvendelse af Malassezia på murine øre hud, og (3) de tekniske detaljer om, hvordan man analyserer Malassezia-induceret hud betændelse og svampe byrden af inficeret hud. Det er vigtigt, at denne model ikke er afhængig af immunsuppression (f. eks. af kortikosteroider) eller antibiotisk behandling af mus før infektion, da den praktiseres i andre musemodeller af svampeinfektion8,9. Til gengæld, det gør det muligt at studere det fulde spektrum af det medfødte og adaptive immunrespons mod Malassezia i den normale hud. Bemærk, at indavlede vildtype mus, der holdes under specifikt patogenfrie (SPF) tilstande, ikke er naturligt koloniseret med Malassezia , og at deres udsættelse for svampen ikke resulterer i vedvarende kolonisering, men fjernes fra værten inden for ca. 1,5 uger. Men, modellen giver mulighed for at studere mekanismerne for svampedræbende vært respons indledning og regulering, som igen, er grundlaget for, hvordan immun hukommelsen genereres. Modellen er alsidig, fordi den let kan anvendes på en lang række genetisk modificerede muse stammer, og den kan kombineres med andre eksisterende hudsygdoms modeller, såsom modeller af barriere mangel, for at undersøge virkningen af Malassezia under patologiske og inflammatoriske hudlidelser7. Derfor er den beskrevne model af eksperimentel Malassezia hudinfektion i mus giver en høj grad af fleksibilitet til at undersøge samspillet mellem svampen med hudens immunsystem i forbindelse med homøostase og sygdom.
Denne protokol beskriver den eksperimentelle hudinfektion hos mus med Malassezia spp. på grund af dets patogene potentiale er Malassezia spp. klassificeret som BSL2 patogener i nogle lande, herunder Schweiz. Tjek venligst de lokale retningslinjer og Følg reglerne fra de lokale myndigheder. BSL2-klassificerede organismer bør håndteres af uddannet personale under et BSL2 certificeret biosikkerheds kabinet (BSC). Biologisk affald, der er forurenet med BSL2-klassificerede organismer, samt slagtekroppe af mus, som er inficeret med sådanne organismer, bør autoklave inden bortskaffelse. Til forsøg med mus bør alle bestræbelser gøres for at minimere lidelser og sikre de højeste etiske og humane standarder i henhold til 3R-principperne (Erstat, forfine, Reducer)10. De eksperimenter, der er beskrevet i denne protokol, blev udført med m. pachydermatis (ATCC 14522), m. ylalkohol (ATCC 14521) og m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Denne protokol beskriver infektion af huden af den almindeligt anvendte indavlede musestamme C57BL/6 af Malassezia spp. tilpasning af denne protokol til andre muse stammer med en anden genetisk baggrund (f. eks. Balb/c) eller til genetisk modificerede mus stammer kan have behov for justering af infektionen dosis, tidspunkt (r) analyse, etc. For at sikre reproducerbarhed bør grupper af mus altid være af samme alder og køn. Kilden til mus bør holdes stabil, da selv små ændringer i den genetiske baggrund og forskellene i mikrobiota, der findes mellem leverandører og kan eksistere selv mellem forskellige enheder af et enkelt avls anlæg, kan have en uforudsigelig indvirkning på løbet af infektionen. Når du konfigurerer Malassezia infektion model, der er beskrevet i denne protokol, anbefales det at udføre en pilotundersøgelse for nøje at overvåge forløbet af infektion, herunder omfanget af kolonisering, kinetik af svampe clearance og graden af betændelse og patologi, der kan blive induceret (f. eks. Hvis ørehuden er forstyrret af barrieren før infektion) for at bestemme de optimale analysebetingelser.
For at sikre reproducerbarhed og for pålideligt at påvise forskelle mellem forsøgsgrupperne skal antallet af dyr, der anvendes pr. gruppe, beregnes på grundlag af den statistiske analyse. Stikprøvestørrelsen beregnes på grundlag af effekt størrelse, fejlfrekvens og effekt, som tager hensyn til biologiske og eksperimentelle variationer (f. eks. på grund af variation i immunsystemet). Af etiske grunde undgå unødigt højt antal dyr. Med hensyn til Malassezia hudinfektion, behandling kun det ene øre med svampen og ved hjælp af det andet øre som en kontrol inden for samme mus, tilrådes ikke, fordi mus kan sprede svampen til begge ører, når grooming. Men ved hjælp af 1/2 øre til forskellige metodologiske aflæsninger såsom bestemmelse af svampe byrde, isolering af immunceller eller histologisk analyse er ofte nok og resulterer i en signifikant reduktion i antallet af dyr, der anvendes til forsøg.
18 forskellige arter af Malassezia er blevet beskrevet op til dato. Inter-og intraspecies variationer inden for slægten Malassezia kan påvirke samspillet med værten, som vi også har lært af undersøgelser af andre humane patogene svampe13. Forskellige Malassezia arter og stammer afviger i deres oprindelse (f. eks m. pachydermatis er de hyppigste arter isoleret fra dyr, mens m. restricta, m. globosa og m. sympodialis er de mest fremtrædende medlemmer af det svampe hudmikrobiom hos mennesker med variabel fordeling af disse arter mellem forskellige hudområder). Nogle arter har været forbundet med commensalism, mens andre menes at være mere sygdomsfremkaldende, selv om detaljerede beviser er relativt svage. Vigtigere er, at nogle arter og stammer er i sagens natur vanskeligere at vokse end andre. Beslutningen om, hvilken art/stamme, der skal anvendes til infektionen, skal derfor baseres på forskningsspørgsmålet.
Eksperimentel infektion af murine huden med nogle mikrobielle organismer såsom Candida albicans eller Staphylococcus aureus kræver afbrydelse af epidermal barriere før infektion, f. eks, med sandpapir14, 15,16. I modsætning hertil er den model af Malassezia infektion, der er beskrevet her, lige så effektiv med og uden barriere forstyrrelse7. Graden af betændelse induceret af svampen er massivt forbedret, hvis huden er tape strippet før infektion7. Derfor, om huden skal manipuleres, før anvendelsen af Malassezia afhænger af forskningen spørgsmål. Der findes forskellige modeller for kronisk og akut hudbetændelse (f. eks. modeller for forsinket type overfølsomhed (DTH) og kontakt overfølsomhed (CHS)) og modeller for barriere mangel, som kan være af interesse for at undersøge bidraget fra kommensal gær til hudpatologier.
Indavlede mus opretholdes under specifikt patogenfrie (SPF) betingelser er (til vores kendskab) ikke naturligt koloniseret med Malassezia. Derfor, den eksperimentelle anvendelse af Malassezia til muse øre hud repræsenterer en primær eksponering for svampen, der inducerer en akut respons i værten, hvilket igen fører til svampe clearance inden for 1-2 uger7. Mens den model, der er beskrevet i denne protokol, derfor kun delvist afspejler situationen hos immunkompetente mennesker eller andre værtsorganismer, som er permanent koloniseret med Malassezia, tillader den eksperimentelle infektion en rigelig vindue af mulighed for at studere svampedræbende immunitet og de cellulære og molekylære mekanismer, der ligger til grund for dette respons. Det giver også mulighed for at undersøge variationer i reaktionen på forskellige Malassezia arter og stammer under forskellige eksperimentelle betingelser (f. eks, med og uden barriere forstyrrelse af huden).
Studiet af Malassezia -Host interaktioner har været begrænset i fortiden til in vitro eksperimenter med isolerede celletyper i kulturer (f. eks keratinocytproliferation cellelinjer, PBMCs). Selv om disse undersøgelser har kastet lys over svampe-og værts determinanter, der former samspillet mellem Malassezia og værten17, tillader de ikke at få en omfattende forståelse af svampen-Host interaktion i komplekset miljø i huden, som involverer flere celletyper, der er i konstant kommunikation, såsom keratinocytter, fibroblaster og væv-residente immunceller, men også leukocyt populationer, der infiltrerer vævet kun ved mikrobiel møde af Hud. Dette multicellulære netværk kan ikke gengives fuldt ud i in vitro-modellerne, selv med de fleste avancerede organoid-systemer. Således, den eksperimentelle infektion af mus stadig repræsenterer den gyldne standard i immunologi og infektionssygdomme forskning, og tilgængeligheden af den model, der er beskrevet her, repræsenterer et gennembrud inden for Malassezia forskning. Det er vigtigt, at denne model er afhængig af den epicutanske anvendelse af Malassezia på den ellers uperturerede muse ørepude, og den implicerer ikke inokulering af svampen ved injektion i vævet, fx subkutant eller intraperitonealt, da tidligere undersøgelser rapporterede18, som begge er mere fjernt fra situationen i naturligt koloniserede værter.
Muligheden for at kombinere den model af Malassezia infektion, der er beskrevet i denne protokol med andre tilgængelige musemodeller i høj grad øger omfanget og fleksibiliteten af ansøgningen. Sidstnævnte omfatter forskellige modeller af specifikke hudlidelser, såsom den model af barriere mangel, der efterligner vigtige funktioner i atopisk dermatitis, en sygdom forbundet med Malassezia i både mennesker og hunde. Desuden kan epiinfeksive infektioner i huden med Malassezia let anvendes på mus med genetiske defekter i værts gener af interesse, eller mus, hvor en celletype af interesse er genetisk slettet eller kan være farmakologisk forarmet (f. eks., ved hjælp af difteri-toksin administration i difteri-toksin receptor-udtrykte mus). Sådanne modeller repræsenterer et uundgåeligt redskab til at dissekere værten respons på kommensal og patogene mikrober, herunder Malassezia, og til at vurdere rollen af disse gener og celletype i svampen-vært interaktion. Analyserne af Malassezia-Host hud interaktion kan udvides langt ud over, hvad der er beskrevet i denne protokol. Disse omfatter analyser af histologi (fx for at bestemme graden af hudpatologi eller epidermal fortykkelse induceret af svampen), ved Immunohistokemi eller immunfluorescent farvning af vævs sektioner ved hjælp af antistoffer rettet mod celletype specifikke markører eller andre molekyler af interesse. Det kan også indebære isolering af celler (f. eks, vævs beboer eller vævs infiltrerende leukocyt-undergrupper) fra det inficerede hudvæv for at studere polariseringen, reguleringen og dynamikken i immunresponset over for Malassezia i stor dybde.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af universitetet i Zürich, Schweiz.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
Native olive oil | – | – | commerc. available |
Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
Peptone | Oxoid | LP0037 | |
Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |