Denne protokollen skisserer etablering av en musemodell for å studere Malassezia-vert interaksjoner i huden. Den beskriver dyrking av Malassezia in vitro, infeksjonen av murine hud med Malassezia, og den påfølgende analyse av betennelsen og sopp belastningen i hud vevet.
Animal modeller er avgjørende for smittsomme sykdommer forskning. De gir et viktig grunnlag for å analysere hele spekteret av interaksjoner som oppstår mellom mikrober og deres vert in vivo i en vev-spesifikk måte. Patogene sopp er i økende grad anerkjent som en alvorlig trussel for mennesker og utnytte slike infeksjons modeller har kraftig forbedret vår forståelse av fungal patogenitet. Arter av slekten Malassezia er de mest tallrike sopp av den menneskelige huden bakterieflora og de er også forbundet med utvikling av alvorlige inflammatoriske hudsykdommer som seboreisk dermatitt og atopisk dermatitt. Men en utløsende sammenheng mellom Malassezia og sykdom patogenesen forblir ukjent, et faktum som kan tilskrives den dårlige kunnskapen om den komplekse crosstalk av Malassezia med hudens immunsystem. Denne protokollen beskriver etablering av en eksperimentell mus modell som gjør det mulig å studere samspillet mellom Malassezia med pattedyr huden in vivo. Den skisserer metoden for dyrking Malassezia spp. under laboratorieforhold, hvordan å infisere murine huden med Malassezia spp. og hvordan å vurdere utfallet av infeksjonen ved hjelp av huden betennelser og sopp byrde analyser. Modellen er beskrevet her fungerer i fullt immunkompetente dyr og ikke stole på immun undertrykkende eller antibiotika forbehandling av dyrene. Det er dessuten tilpasningsdyktig til nesten alle genmodifiserte mus stammer og kan kombineres med andre hudsykdom modeller. Disse funksjonene gjør denne infeksjonen modellen et svært kraftig verktøy for å studere i detalj medfødt og adaptive immunrespons av verten mot Malassezia i huden in vivo.
Huden er befolket av mange forskjellige mikrober. Den konstante eksponeringen av huden til bakterieflora bidrar til å forme og utdanne immunsystemet til verten. Sopp blir stadig mer anerkjent som en viktig del av bakterieflora og de oppfyller en viktig rolle for verts fysiologi og immunitet, ligner på bakterier og virus1. Arter av slekten Malassezia er den desidert mest tallrike sopp kolonisere huden av varm-blods virveldyr og de gjør opp for mer enn 90% av den menneskelige huden mycobiome2,3. Atten forskjellige arter av Malassezia har så langt blitt identifisert fra menneske og dyr hud4.
Ulike sykdommer i huden antas å oppstå, i hvert fall delvis, som et resultat av en dysbalanced bakterieflora sammensetning. Dysbiosis kan føre til overvekst av arter med patogene potensial som resulterer i opportunistiske infeksjoner og sykdom5. Konsekvent, det er en økende bevis for at Malassezia, foruten sin Commensal livsstil, bidrar til utvikling av ulike hudsykdommer, alt fra flass og pityriarsis versicolor til mer alvorlige inflammatoriske lidelser som seboreisk dermatitt og atopisk dermatitt4,6. Mens en utløsende ledd mellom Malassezia og pityriarsis versicolor er etablert, er patofysiologiske rolle soppen i mer alvorlige hudsykdommer fortsatt i stor grad ukjent.
Bestemme rollen til Malassezia i huden homeostase og sykdom krever mer inngående kunnskap om samspillet av soppen med hud og hud immunsystem. Av notatet, forskning på Malassezia er, sammenlignet med andre humane fungal patogener (f. eks, Candida albicans eller Aspergillus fumigatus), fortsatt i den nyopprettede scenen. Dette kan tilskrives vanskeligheten i dyrking av Malassezia under laboratorieforhold og mangelen på egnede eksperimentelle modeller for å studere soppen i kontakt med verten in vivo. Tidligere eksperimenter med isolerte celler i kulturen indikerte et bredt spekter av direkte og indirekte interaksjoner mellom Malassezia og ulike immun-og ikke-immune celler7. Men disse in vitro eksperimenter bare delvis recapitulate situasjonen av den komplekse hud miljø in vivo der mange cellulære og molekylære hendelser oppstår samtidig mellom soppen og ulike celletyper.
Her skisserer vi protokollen for en eksperimentell modell av Malassezia hud infeksjon i mus, som vi nylig har etablert, for å studere sopp-vert samhandling i vivo7. Dette inkluderer prosedyrer for (1) vellykket dyrking av Malassezia in vitro, (2) den epicutaneous anvendelsen av Malassezia på murine øre hud, og (3) de tekniske detaljene om hvordan å analysere Malassezia-indusert hud inflammasjon og sopp byrden av smittet hud. Viktigere, ikke denne modellen ikke stole på immunsuppresjon (f. eks av kortikosteroider) eller antibiotika behandling av mus før infeksjon, som det er praktisert i andre musemodeller av fungal infeksjon8,9. I sin tur, det kan studere hele spekteret av medfødte og adaptive immunrespons mot Malassezia i normal hud. Av notatet, innavlet vill type mus holdt under spesifikke patogen-fri (SPF) forholdene er ikke naturlig kolonisert med Malassezia og derfor deres eksponering for soppen ikke resulterer i vedvarende kolonisering, men er ryddet fra verten innen omtrent 1,5 uker. Men gjør modellen for å studere mekanismer av Antifungal vert respons initiering og regulering som i sin tur er grunnlaget for hvordan immun hukommelse er generert. Modellen er allsidig i at den lett kan brukes på en rekke genmodifiserte mus stammer og det kan kombineres med andre eksisterende hudsykdom modeller, for eksempel modeller av barriere mangel, for å studere virkningen av Malassezia under patologiske og inflammatoriske hud forhold7. Derfor, den beskrevne modellen av eksperimentell Malassezia hud infeksjon i mus gir en høy grad av fleksibilitet til å undersøke samspillet av soppen med hudens immunsystem i sammenheng med homeostase og sykdom.
Denne protokollen beskriver eksperimentell hud infeksjon av mus med Malassezia spp. på grunn av dens patogene potensial, Malassezia spp. er klassifisert som BSL2 patogener i noen land, inkludert Sveits. Vennligst undersøk de lokale retningslinjene og følg forskriftene fra de lokale myndighetene. BSL2-klassifiserte organismer skal håndteres av opplært personell under et BSL2-sertifisert biosafety kabinett (BSC). Biologisk avfall forurenset med BSL2-klassifiserte organismer, så vel som, skrotter fra mus smittet med slike organismer bør være autoklaveres før avhending. For eksperimenter med mus bør alle anstrengelser gjøres for å minimere lidelsen og sikre de høyeste etiske og humane standardene i henhold til 3R-prinsippene (erstatte, avgrense, redusere)10. Eksperimentene beskrevet i denne protokollen ble utført med m. pachydermatis (ATCC 14522), m. furfur (ATCC 14521) og m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Denne protokollen beskriver infeksjon i huden av den brukte innavlet musen belastningen C57BL/6 av Malassezia spp. tilpasse denne protokollen til andre mus stammer med en annen genetisk bakgrunn (f. eks, Balb/c) eller til genmodifisert mus belastninger kan trenge justering av infeksjons dosen, tids punktet (e) av analysen, etc. For å sikre reproduserbarhet, bør grupper av mus alltid være av samme alder og kjønn. Kilden til mus bør holdes stabil, som selv små endringer i genetisk bakgrunn og forskjeller i bakterieflora, som eksisterer mellom leverandører og kan eksistere selv mellom ulike enheter av en enkelt avl anlegget, kan ha en uforutsigbar innvirkning på løpet av infeksjonen. Når du setter opp Malassezia infeksjon modellen som er beskrevet i denne protokollen, er det anbefalt å utføre en pilotstudie for å nøye overvåke løpet av infeksjonen, inkludert omfanget av kolonisering, Kinetics av fungal clearance og graden av betennelse og patologi som kan være indusert (f. eks, hvis øret huden er barriere-forstyrret før infeksjon) for å fastslå den optimale analysen forhold.
For å sikre reproduserbarhet og for å oppdage forskjellene mellom eksperimentelle grupper på en pålitelig måte, må antallet dyr som brukes per gruppe, beregnes basert på den statistiske analysen. Utvalgsstørrelsen beregnes basert på effekt størrelse, feil hastighet og kraft, som vurderer biologiske og eksperimentelle variasjoner (f.eks. på grunn av variasjon i immunsystemet). For etiske grunner unngå å bruke unødvendig høyt antall dyr. Når det gjelder Malassezia hud infeksjon, behandle bare ett øre med soppen og bruke det andre øret som en kontroll i samme mus, er ikke anbefalt fordi mus kan spre soppen til begge ørene når grooming. Men, ved hjelp 1/2 øre for ulike metodisk lese outs som fastsettelse av sopp byrde, isolering av immunceller eller histologiske analyse er ofte nok og resulterer i en betydelig reduksjon i dyre tall som brukes for eksperimenter.
18 forskjellige arter av Malassezia har blitt beskrevet oppdatert. Inter-og artsspesifikke variasjoner i slekten Malassezia kan påvirke samspillet med verten, som vi også har lært fra studier på andre menneskelige patogene sopp13. Ulike Malassezia arter og stammer varierer i deres opprinnelse (f. eks, m. pachydermatis er de hyppigste artene isolert fra dyr, mens m. restricta, m. barlind og m. sympodialis er de prominente medlemmer av sopp hud mikrobiomet hos mennesker med variabel fordeling av disse artene mellom ulike hudområder). Noen arter har blitt assosiert med commensalism, mens andre er antatt å være mer patogene, selv om detaljerte bevis forblir relativt svake. Viktigere, noen arter og stammer er iboende vanskeligere å vokse enn andre. Dermed beslutningen om hvilke arter/belastning å bruke for infeksjonen må være basert på spørsmålet om forskning.
Eksperimentell infeksjon i murine hud med noen mikrobielle organismer som Candida albicans eller Staphylococcus aureus krever avbrudd av epidermal barriere før infeksjon, for eksempel, med sandpapir14, 15,16. I kontrast er modellen av Malassezia infeksjon beskrevet her er like effektiv med og uten barriere avbrudd7. Graden av betennelse indusert av soppen er massivt forbedret hvis huden er tape strippet før infeksjon7. Derfor, om huden skal manipuleres før påføring av Malassezia avhenger av forskningsspørsmål. Ulike modeller av kronisk og akutt hud betennelse (f. eks, modeller for forsinket type overfølsomhet (DTH) og kontakt overfølsomhet (CHS)) og modeller av barriere mangel finnes som kan være av interesse for å undersøke bidraget av Commensal gjær til hudsykdommer.
Innavlet mus opprettholdt under spesifikke patogen gratis (SPF) forholdene er (til vår kunnskap) ikke naturlig kolonisert med Malassezia. Derfor, den eksperimentelle anvendelsen av Malassezia til musen øret huden representerer en primær eksponering for soppen som induserer en akutt respons i verten, som igjen fører til sopp klaring innen 1-2 uker7. Mens modellen beskrevet i denne protokollen derfor bare delvis reflekterer situasjonen i immunkompetente mennesker eller andre verter organismer som er permanent kolonisert med Malassezia, den eksperimentelle infeksjonen tillater en rikelig vindu av mulighet til å studere Antifungal immunitet og cellulære og molekylære mekanismer som ligger til grunn dette svaret. Det kan også undersøke variasjoner i responsen på ulike Malassezia arter og stammer under ulike eksperimentelle forhold (f. eks med og uten barriere forstyrrelse av huden).
Studiet av Malassezia -vert interaksjoner har vært begrenset i fortiden til in vitro eksperimenter med isolerte celletyper i kulturer (f. eks, Keratinocyte cellelinjer, pbmc). Selv om disse studiene har kaste lys over sopp og vert faktorer som former samspillet mellom Malassezia og verten17, de ikke tillater å få en helhetlig forståelse av sopp-vert samhandling i komplekse miljø av huden, som involverer flere celletyper som er i konstant kommunikasjon, for eksempel keratinocytter, fibroblaster og vev-Resident immunceller, men også leukocytter populasjoner som infiltrere vevet bare ved mikrobiell møte i Huden. Dette flercellede nettverket kan ikke gjengis fullt ut i in vitro-modellene, selv med de mest avanserte organoid systemene. Således, det eksperimentelle infeksjon av mus fremdeles representerer gullet målestokk inne immunologi og infeksjon sykdommen forskning, og anvendeligheten av modellen beskrevet her over representerer en gjennombruddet inne feltet av Malassezia forskning. Viktigere, denne modellen er avhengig av epicutaneous anvendelse av Malassezia på den ellers Uaffisert musen øret hud, og det ikke implisere inoculation av soppen ved injeksjon i vevet, f. eks subkutant eller intraperitonealt, som tidligere studier rapporterte18, som begge er fjernere fra situasjonen i naturlig kolonisert verter.
Muligheten til å kombinere modellen av Malassezia infeksjon beskrevet i denne protokollen med andre tilgjengelige musemodeller øker betraktelig omfanget og fleksibiliteten til programmet. Sistnevnte omfatter ulike modeller av spesifikke hud lidelser, slik som modell av barriere mangel som etterligner viktige funksjoner i atopisk dermatitt, en sykdom forbundet med Malassezia i både mennesker og hunder. Videre epicutaneous infeksjon i huden med Malassezia kan lett påføres mus med genetiske defekter i vert gener av interesse, eller mus der en celle type interesse er genetisk slettet eller kan farmakologisk utarmet (f. eks, ved hjelp av difteri gift administrasjon i difteri gift reseptor-uttrykker mus). Slike modeller representerer et uunngåelig verktøy for å dissekere verten respons på Commensal og patogene mikrober, inkludert Malassezia, og å vurdere hvilken rolle disse genene og celle type i soppen-vert interaksjon. Analysene av Malassezia-verten hud interaksjon kan utvides langt utover det som er beskrevet i denne protokollen. Disse inkluderer analyser av histologi (for eksempel for å fastslå graden av hud patologi eller epidermal tykkelse indusert av soppen), ved immunhistokjemi eller immunofluorescent farging av vevs deler ved hjelp av antistoffer rettet mot celle type spesifikke markører eller andre molekyler av interesse. Det kan også innebære isolering av celler (f. eks, vev bosatt eller vev-infiltrere leukocytter delsett) fra det infiserte hud vevet å studere polarisering, regulering, og dynamikk av immunrespons til Malassezia i stor dybde.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av universitetet i Zürich, Sveits.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
Native olive oil | – | – | commerc. available |
Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
Peptone | Oxoid | LP0037 | |
Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |