Detta protokoll beskriver inrättandet av en musmodell för att studera Malassezia-värd interaktioner i huden. Det beskriver odling av Malassezia in vitro, infektionen av den murina huden med Malassezia, och den efterföljande analysen av inflammationen och svamp bördan i huden vävnad.
Djurmodeller är avgörande för forskning om infektionssjukdomar. De utgör en viktig grund för att analysera hela spektrumet av interaktioner som uppstår mellan mikrober och deras värd in vivo på ett vävnads-specifikt sätt. Patogena svampar erkänns alltmer som ett allvarligt hot för människor och utnyttja sådana infektions modeller har avsevärt förbättrat vår förståelse av svamp patogenicitet. Arter av släktet Malassezia är de vanligast förekommande svampar av den mänskliga huden bakterieflora och de är också förknippade med utvecklingen av svåra inflammatoriska hudsjukdomar såsom seborroiskt eksem och atopisk dermatit. Emellertid, en orsakande länk mellan Malassezia och sjukdomens patogenes förblir okänd, ett faktum som kan hänföras till den dåliga kunskapen om den komplexa överhörning av Malassezia med hudens immunförsvar. Detta protokoll beskriver inrättandet av en experimentell musmodell som gör det möjligt att studera samspelet mellan Malassezia och däggdjurs huden in vivo. Den beskriver metoden för odling av Malassezia spp. under laboratorieförhållanden, hur man infekterar murina huden med Malassezia spp. och hur man bedömer resultatet av infektion med hjälp av hudinflammation och svamp bördan analyser. Den modell som beskrivs här fungerar i fullt immunkompetenta djur och inte förlita sig på immunsuppressiv eller antibiotika förbehandling av djuren. Det är dessutom anpassningsbar till praktiskt taget alla genetiskt modifierade mus stammar och kan kombineras med andra hud sjukdomsmodeller. Dessa funktioner gör denna infektion modell ett mycket kraftfullt verktyg för att studera i detalj den medfödda och adaptiva immunsvar av värden mot Malassezia i huden in vivo.
Huden fylls av många olika mikrober. Den ständiga exponeringen av huden till bakterieflora bidrar till att forma och utbilda värdens immunförsvar. Svampar erkänns alltmer som en viktig del av bakterieflora och de uppfyller en viktig roll för värdfysiologi och immunitet, liknande bakterier och virus1. Arter av släktet Malassezia är den överlägset vanligast förekommande svampar kolonisera huden på varmblodiga ryggradsdjur och de utgör mer än 90% av den mänskliga huden mycobiome2,3. Arton olika arter av Malassezia har hittills identifierats från människa och djur hud4.
Olika patologier av huden tros uppstå, åtminstone delvis, som ett resultat av en dysbalanced bakterieflora sammansättning. Dysbiosis kan leda till överväxt av arter med patogena potential som resulterar i opportunistiska infektioner och sjukdom5. Konsekvent, det finns ett ökande bevis för att Malassezia, förutom dess kommensaler livsstil, bidrar till utvecklingen av olika hud patologier, allt från mjäll och pityriarsis versicolor till mer allvarliga inflammatoriska sjukdomar såsom som seborroiskt eksem och atopisk dermatit4,6. Medan en orsakande länk mellan Malassezia och pityriarsis versicolor har fastställts, den patofysiologiska roll svampen i mer allvarliga hud patologier fortfarande i stort sett okänd.
Bestämma rollen av Malassezia i huden homeostas och sjukdom kräver mer djupgående kunskap om samspelet mellan svampen med huden och det kutana immunförsvaret. Notera, forskning om Malassezia är, jämfört med andra mänskliga svamp patogener (t. ex., Candida albicans eller Aspergillus fumigatus), fortfarande i spirande skede. Detta kan hänföras till svårigheten i odling av Malassezia under laboratorieförhållanden och avsaknaden av lämpliga experimentella modeller för att studera svampen i kontakt med värden in vivo. Tidigare experiment med isolerade celler i kulturen indikerade ett brett spektrum av direkta och indirekta interaktioner mellan Malassezia och olika immun-och icke-immunceller7. Emellertid, dessa in vitro-experiment endast delvis recapitulate situationen för den komplexa hud miljön in vivo där många cellulära och molekylära händelser uppträder samtidigt mellan svampen och olika celltyper.
Häri, vi skissera protokollet för en experimentell modell av Malassezia hudinfektion hos möss, som vi nyligen etablerat, att studera svamp-värd interaktion in vivo7. Detta inbegriper förfaranden för (1) en lyckad odling av Malassezia in vitro, (2) epikutan applicering av Malassezia på den murina örat huden, och (3) de tekniska detaljerna för hur man analyserar Malassezia-inducerad hud inflammation och svamp bördan av infekterad hud. Viktigt är att denna modell inte förlitar sig på immunsuppression (t. ex. genom kortikosteroider) eller antibiotikabehandling av möss före infektion, eftersom det praktiseras i andra musmodeller av svampinfektion8,9. I sin tur, det gör det möjligt att studera hela spektrumet av den medfödda och adaptiva immunsvar mot Malassezia i normal hud. Notera, inavlade vild typ möss hålls under specifika patogen-fria (SPF) villkor är inte naturligt koloniseras med Malassezia och därför är deras exponering för svampen inte resultera i ihållande kolonisering men rensas från värden inom cirka 1,5 veckor. Emellertid, modellen gör det möjligt för att studera mekanismerna för svampdödande värd svar initiering och reglering som, i sin tur, är grunden för hur immun minne genereras. Modellen är mångsidig på så sätt att den lätt kan appliceras på en mängd genetiskt modifierade mus stammar och den kan kombineras med andra befintliga modeller av hudsjukdomar, såsom modeller av barriär brist, för att studera effekten av Malassezia under patologiska och inflammatoriska hudåkommor7. Därför, den beskrivna modellen av experimentell Malassezia hudinfektion hos möss ger en hög grad av flexibilitet för att undersöka samspelet mellan svampen med hudens immunförsvar i samband med homeostas och sjukdom.
Detta protokoll beskriver den experimentella hud infektionen hos möss med Malassezia spp. på grund av dess patogena potential klassificeras Malassezia spp. som BSL2 patogener i vissa länder, däribland Schweiz. Vänligen kontrollera de lokala riktlinjerna och följ de lokala myndigheternas föreskrifter. BSL2-klassificerade organismer bör hanteras av utbildad personal under ett BSL2-certifierat biosäkerhetsskåp (BSC). Biologiskt avfall som kontaminerats med BSL2-klassificerade organismer, samt slaktkroppar från möss som infekterats med sådana organismer, bör autoklaveras före bortskaffandet. För experiment med möss, alla ansträngningar bör göras för att minimera lidande och säkerställa högsta etiska och humana normer enligt 3R principer (Ersätt, förfina, minska)10. De experiment som beskrivs i detta protokoll utfördes med m. pachydermatis (atcc 14522), m. furfur (ATCC 14521) och m. sympodialis (ATCC 42132)7.
Detta protokoll beskriver infektion i huden hos den vanligen använda inavlade mus stammen C57BL/6 av Malassezia spp. anpassning av detta protokoll till andra mus stammar med en annan genetisk bakgrund (t. ex. Balb/c) eller till genetiskt modifierad mus stammar kan behöva justering av infektions dosen, tidspunkten (s) analys, etc. För att säkerställa reproducerbarhet bör grupper av möss alltid ha samma ålder och kön. Källan till möss bör hållas stabil, eftersom även smärre förändringar i den genetiska bakgrunden och skillnader i bakterieflora, som finns mellan leverantörer och kan existera även mellan olika enheter av en enda avelsanläggning, kan ha en oförutsägbar inverkan på infektionsförloppet. När du ställer in Malassezia infektion modell som beskrivs i detta protokoll, det rekommenderas att utföra en pilotstudie för att noggrant övervaka förloppet av infektionen, inklusive omfattningen av kolonisering, kinetik av svamp clearance och graden av inflammation och patologi som kan induceras (t. ex. om öron huden är barriär-störd före infektion) för att bestämma de optimala testförhållandena.
För att säkerställa reproducerbarheten och på ett tillförlitligt sätt upptäcka skillnader mellan försöks grupperna måste antalet djur som används per grupp beräknas utifrån den statistiska analysen. Urvalsstorleken beräknas utifrån effekt storlek, felfrekvens och effekt, som beaktar biologiska och experimentella variationer (t. ex. på grund av variation i immunsystemet). Av etiska skäl undvika att använda onödigt höga antal djur. När det gäller Malassezia hudinfektion, behandla endast ett öra med svampen och använda det andra örat som en kontroll inom samma mus, rekommenderas inte eftersom möss kan sprida svampen till båda öronen när grooming. Men med 1/2 öra för olika metodologiska Läs outs såsom bestämning av svamp börda, isolering av immunceller eller histologisk analys är ofta tillräckligt och resulterar i en signifikant minskning av djur nummer som används för experiment.
18 olika arter av Malassezia har beskrivits aktuella. Inter-och kommunikation variationer inom släktet Malassezia kan påverka interaktionen med värden, som vi också har lärt oss från studier på andra mänskliga patogena svampar13. Olika Malassezia arter och stammar skiljer sig i deras ursprung (t. ex., m. pachydermatis är den mest frekventa arter isolerade från djur, medan m. Auktor, m. Auktor och m. sympodialis är de mest framstående medlemmar av den fungal flå microbiomen i människor med variabel fördelning av dessa art mellan olika flå områden). Vissa arter har förknippats med commensalism, medan andra tros vara mer patogena, även om detaljerade bevis är fortfarande relativt svag. Viktigare, vissa arter och stammar är till sin natur svårare att växa än andra. Beslutet om vilken art/stam som ska användas för infektionen måste således grundas på forskningsfrågan.
Experimentell infektion i murina huden med vissa mikrobiella organismer såsom Candida albicans eller Staphylococcus aureus kräver störning av den epidermala barriären före infektion, e.g., med sandpapper14, 15,16. Däremot är den modell av Malassezia infektion som beskrivs här lika effektiv med och utan barriär störning7. Graden av inflammation som induceras av svampen förstärks kraftigt om huden är tejp strippad före infektion7. Därför, om huden ska manipuleras innan tillämpningen av Malassezia beror på forskningsfrågan. Olika modeller av kronisk och akut hudinflammation (t. ex. modeller för fördröjd typ överkänslighet (DTH) och kontakt överkänslighet (CHS)) och modeller av barriär brist finns som kan vara av intresse för att utreda bidraget av kommensaler jäst till hud patologier.
Inavlade möss som underhålls under specifika patogenfria (SPF) villkor är (enligt vår kännedom) inte naturligt koloniserade med Malassezia. Därför är den experimentella tillämpningen av Malassezia till mus örat huden en primär exponering för svampen som inducerar ett akut svar i värden, vilket i sin tur leder till svamp clearance inom 1-2 veckor7. Medan den modell som beskrivs i detta protokoll därför endast delvis återspeglar situationen hos immunkompetenta människor eller andra värdorganismer som permanent koloniseras med Malassezia, möjliggör den experimentella infektionen ett stort fönster av möjlighet att studera svampdödande immunitet och cellulära och molekylära mekanismer som ligger bakom detta svar. Det gör det också möjligt att undersöka variationer i svaret på olika Malassezia arter och stammar under olika experimentella förhållanden (t. ex., med och utan barriär störning i huden).
Studiet av Malassezia -värd interaktioner har varit begränsade i det förflutna till in vitro-experiment med isolerade celltyper i kulturer (t. ex., keratinocyter cellinjer, pbmcs). Även om dessa studier har sprida lite ljus över svamp och värden determinanter som formar samspelet mellan Malassezia och värd17, de tillåter inte att få en omfattande förståelse av svamp-värd interaktion i komplexet miljö i huden, som involverar flera celltyper som är i ständig kommunikation, såsom keratinocyter, fibroblaster och vävnad bosatta immunceller, men också leukocyter populationer som infiltrera vävnaden endast på mikrobiell möte i Hud. Detta flercelliga nätverk kan inte återges helt i in vitro-modellerna, även med de flesta avancerade Organoid system. Således är den experimentella infektionen av möss fortfarande den gyllene standarden inom immunologi och infektionssjukdomar forskning, och tillgängligheten av den modell som beskrivs här utgör ett genombrott inom området Malassezia forskning. Viktigare, denna modell förlitar sig på epikutan applicering av Malassezia på den annars ogenomträngbara mus öra huden, och det inte implerar inympning av svampen genom injektion i vävnaden, e.g., subkutant eller intraperitonealt, som tidigare studier rapporterade18, som båda är mer avlägsen från situationen i naturligt koloniserade värdar.
Möjligheten att kombinera den modell av Malassezia infektion som beskrivs i detta protokoll med andra tillgängliga musmodeller ökar kraftigt omfattningen och flexibiliteten i programmet. Den senare omfattar olika modeller av specifika hudsjukdomar, såsom modellen av barriär brist som härmar viktiga egenskaper hos atopisk dermatit, en sjukdom som förknippas med Malassezia hos både människor och hundar. Dessutom kan epikutana infektioner i huden med Malassezia lätt appliceras på möss med genetiska defekter i värd gener av intresse, eller möss där en celltyp av intresse är genetiskt utplånas eller kan vara farmakologiskt utarmat (t. ex., med hjälp av difteri toxin administration i difteri toxin receptor-uttrycker möss). Sådana modeller utgör ett oundvikligt verktyg för dissekera värd svar på kommensaler och patogena mikrober, inklusive Malassezia, och att bedöma vilken roll dessa gener och celltyp i svampen-värd interaktion. Analyserna av Malassezia-Host hud interaktion kan utökas långt bortom vad som beskrivs i detta protokoll. Dessa inkluderar analyser av histologi (t. ex. för att bestämma graden av hudpatologi eller epidermal förtjockning inducerad av svampen), genom immunohistokemi eller Immunofluorescerande färgning av vävnad sektioner med antikroppar riktade mot celltyp specifika markörer eller andra molekyler av intresse. Det kan också innebära isolering av celler (t. ex., vävnad bosatt eller vävnad-infiltrerande leukocyter undergrupper) från den infekterade huden vävnad att studera polarisering, reglering, och dynamik i immunförsvaret mot Malassezia i stort djup.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av universitetet i Zürich, Schweiz.
Agar | Sigma-Aldrich | A1296-1KG | |
Attane Isoflurane | Piramal Healthcare | – | |
Biosaftey cabinet (BSC) Faster Ultra Safe | DASIT GROUP | TEC 5594 | BSL2 certified |
Centrifuge | Eppendorf | 5415D | compatible with 2ml Eppendorf tubes |
Dessicated Ox-bile | Sigma-Aldrich | 70168-100G | |
Eppendorf Tubes (2 ml) | Eppendorf | 0030 120.094 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | 49159-5KG | |
Gylcerol (99 %) | Honeywell | 10314830 | |
Heating pad | Eickenmeyer | 648048 | |
Incubator Hereaus B20 | Heraeus | 412047753 | BSL2 certified |
Ketasol (100 mg) | Graeub AG | 6680416 | |
Magentic heating plate MR Hei-Standard | Heidolph Instruments | 442-1355 | |
Malassezia spp. | ATCC | 14522, 14521, 42132 | |
Malt extract | Sigma-Aldrich | 70167-500G | |
Multiply Biosphere Tubes (200 µl) | Sarstedt AG | 7084211 | Safelock |
Native olive oil | – | – | commerc. available |
Nonidet P40 | Axon Lab | A1694,0250 | |
Oditest measurment devise | Kroeplin | S0247 | range 0-5 mm |
Oleic Acid | Sigma-Aldrich | 75090-5ML | |
Peptone | Oxoid | LP0037 | |
Petri dishes | Sarstedt AG | 82.1473 | |
Phosphat buffered salt solution (PBS, 1x) | Amimed/Bioconcept | 3-05F39 | |
Rompun (2 %) | Bayer | KP0BFHR | |
Shaking incubator Infors Minitron | Infors | – | BSL2 certified |
Spectrometer | Jenway | 20308 | optical density measurement at 600nm |
Spectrometer Cuvettes | Greiner Bio-One | 613101 | |
Stainless Steel balls (5mm) | ABF | KU.5G80 1.3541 | |
Syringes 1 ml Sub-Q | BD Bioscience | 305501 | |
Tissue Lyzer II | Quiagen | 85300 | |
Transpore Hypoallergic Tape | 3M | 1527-1 | |
Tween 40 | Sigma-Aldrich | P1504-100ML | |
Vitamin A Retinoli Palmitas Eye Cream | BAUSCH & LOMB | commerc. available |