Nous avons exposé un système microphysiologique (MPS) avec des organoïdes intestinaux et hépatiques à l’acétaminophène (APAP). Cet article décrit les méthodes de production d’organoïdes et d’évaluations des biens pharmacocinétiques et toxicologiques de l’APAP dans le SPM. Il décrit également les analyses de fonctionnalité tissulaire nécessaires pour valider les résultats.
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Article de méthode
Un système microphysiologique intestinal/hépatique pour l’évaluation pharmacocinétique et toxicologique des médicaments
Dans cet article
Résumé
Résumé
On s’attend à ce que les systèmes microphysiologiques (MPS) récemment introduits cultivant des organoïdes humains obtiennent de meilleurs résultats que les animaux dans la phase de tests précliniques du processus de développement de médicaments parce qu’ils sont génétiquement humains et récapitulent l’interaction entre les tissus. Dans cette étude, la barrière intestinale humaine (imitée par une co-culture des cellules Caco-2 et HT-29) et l’équivalent hépatique (imité par des sphéroïdes faits de cellules hepaRG différenciées et de cellules stellates hépatiques humaines) ont été intégrées dans un dispositif microfluidique à puce à deux organes (2 OC) pour évaluer certaines propriétés pharmacocinétiques (PK) et toxicologiques de l’acétaminophène (APAP). Le MPS a eu trois assemblées : intestin seulement 2-OC, foie seulement 2-OC, et intestin/foie 2-OC avec le même média perfusant les deux organoïdes. Pour les évaluations pk, nous avons dosé l’APAP dans les médias à des points de temps prédéfinis après l’avoir administré soit au-dessus de la barrière intestinale (émulation de la voie orale) ou dans les médias (émulsionnant la voie intraveineuse), à 12 μM et 2 μM respectivement. Les échantillons de médias ont été analysés par chromatographie liquide à haute pression (HPLC) en phase inversée. Des organoïdes ont été analysés pour l’expression de gène, pour des valeurs de TEER, pour l’expression et l’activité de protéine, et puis rassemblés, fixés, et soumis à un ensemble d’évaluations morphologiques. La technique MTT a bien fonctionné dans l’évaluation de la viabilité organoïde, mais les analyses à haute teneur (HCA) ont pu détecter des événements toxiques très tôt en réponse au traitement d’APAP. Nous avons vérifié que le flux de médias n’affecte pas significativement l’absorption apap alors qu’il améliore considérablement la fonctionnalité équivalent foie. L’absorption intestinale humaine d’APAP et le métabolisme hépatique pourraient être imités dans le MPS. L’association entre les données MPS et dans la modélisation silico a un grand potentiel pour améliorer la prévisibilité des méthodes in vitro et fournir une meilleure précision que les modèles animaux dans les études pharmacocinétiques et toxicologiques.
Introduction
En raison des différences génomiques et protéomiques, les modèles animaux ont une valeur prédictive limitée pour plusieurs résultats humains. En outre, ils sont longs, coûteux et éthiquement discutables1. MPS est une technologie relativement nouvelle qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Ce sont des dispositifs microfluidiques cultivant des organoïdes (unités fonctionnelles mimétiques artificielles d’organes) sous flux médiatique qui favorise la communication organoïde-organoïde. Les organoïdes faits de cellules humaines augmentent la pertinencetransla....
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Protocole
1. Production d’équivalents tissulaires pour la culture dans le 2-OC
- Production équivalente de barrière d’intestin grêle
- Maintenir les cellules Caco-2 et HT-29 à l’aide du milieu équivalent intestinal : DMEM complété par 10 % de FBS, 1 % de pénicilline et de streptomycine, et 1 % d’acides aminés non essentiels, qui est nommé « DMEM S » dans ce manuscrit.
- Retirer le milieu, laver deux fois avec 1x DPBS et ajouter 8 mL de 0,25% trypsine/EDTA pour dissocier les cellules Caco-2 cultivées dans des flacons de culture cellulaire (175 cm2). Incuber pendant 5 min à 37 °C et arrêter la réaction en ajoutant au moins le double volume d’inhi....
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Résultats
Pour effectuer les tests PK APAP dans le MPS 2-OC, la première étape consiste à fabriquer l’intestin humain et les équivalents hépatiques (organoïdes). Ils sont intégrés dans le dispositif microfluidique 2-OC (Figure 1A) 24 h avant le début de l’essai PK APAP. Le lendemain, le support est modifié, et le modèle est exposé à l’APAP. La figure 1 illustre l’intestin et les équivalents hépatiques placés à l’intérieur du dispositif 2-OC (figure 1B.......
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Discussion
L’évaluation précise et fiable des propriétés pharmacologiques des nouveaux médicaments d’investigation est essentielle pour réduire le risque dans les étapes de développement suivantes. Le MPS est une technologie relativement nouvelle, qui vise à améliorer la puissance prédictive et à réduire les coûts et le temps consacrés aux tests précliniques. Notre groupe progresse dans l’évaluation des propriétés pharmacocinétiques et toxicologiques principalement nécessaires à l’optimisation du plomb. Nous avons travaillé avec le.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions le Dr Christie Guguen-Guillouzo, le Dr Philippe Gripon de l’Unité 522 INSERM et le Dr Christian Trepo de l’Unité 271 INSERM pour l’utilisation du matériel biologique (cellules Hepa RG) et pour nous avoir mis à notre disposition afin d’effectuer la recherche universitaire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | Sans calcium, sans magnésium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Puce à deux organes | |
| Microplaque sphéroïde 384 puits | Corning | 3830 | Noir/Clair, Fond rond, Attachement ultra-faible |
| 4 % Paraformaldéhyde | Utiliser pour fixer la cellule | ||
| Acétaminophène | Sigma Aldrich | A7085 | Utilisation pour les dosages MPS |
| Acétonitrile | Tedia | Utilisé pour réaliser la HPLC | |
| Alexa Fluor 647 Phalloïdine | Thermo Fisher Expérience confocale scientifique | ||
| Acétate d’ammonium | Sigma Aldrich | Utilisé pour réaliser la HPLC | |
| Cellules Caco-2 | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate Tampon | |||
| Flacons | de culture cellulaireSarstedt | ||
| Microscope confocal à fluorescence | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Ajouter des suppléments : 10 % de sérum bovin fœtal, 100 unités par mL de pénicilline, 100 & micro ; g/mL de streptomycine et 1 % d’acides aminés non essentiels |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Ajouter 2 % au milieu HepaRG |
| Éthanol | Synthé Sérum | ||
| fœtal bovin | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Moyen de congélation OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® ; O.C.T.&négoce ; Le composé est une formulation de glycols et de résines hydrosolubles, fournissant une matrice d’échantillon pratique pour le sectionnement du cryostat à des températures de -10° ; C et inférieurs. | |
| Hématoxyline et Cellules Eosin | |||
| HepaRG | Biopredic International | HPR101 | Cellules indifférenciées |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cellules et tous les suppléments de culture |
| Hoechst 33342 | HCA expériences | ||
| HT-29 cellules | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Insuline humaine | Invitrogen - Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky' s fixateur | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 colonne de garde SS | Phenomenex | Utilisé pour effectuer un microscope HPLC | |
| Leica | DMi4000 | ||
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µ ; m inserts de taille de pores | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 mètre | Merck | MERS00002 | Utilisé pour la mesure TEER |
| MitoTracker Deep Red | HCA expériences | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P système | Agilent Technologies | ||
| Chambre | NeubauerComptage de cellules | ||
| Operetta Système d’imagerie à haut contenu | Perkin Elmer | Utilisé pour effectuer le dosage HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 avec Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Pénicilline/Streptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Culture cellulaire |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | ||
| Histology Primers | RT-qPCR | ||
| Membrane PVDF | BioRad | ||
| PVDF Filtre | 0.22 &mu ; m taille | ||
| des pores Colonne Luna C18 en phase inverse | Phenomenex | Utilisé pour effectuer un agitateur HPLC | |
| (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Utilisé pour les sphéroïdes afin d’améliorer le dosage MTT |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Ajouter des suppléments STeC CM |
| SuperScriptIITM Transcriptase inverse | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| Réactif TRizol TM | Thermo Fisher Scientific | Trizol est une solution monophasique de phénol et d’isothiocyanate de guanidine. | |
| Solution trypsine/EDTA | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Plaques à fixation ultra-basse | Corning | CLS3471-24EA | 6 puits |
| Vectashield plus support | |||
| DAPI Blanc Opaque 96 puits | Microplaque PerkinHelmer | ||
| Embouts à alésage | |||
| large Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Ajouter des suppléments : 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 unités par ml de pénicilline, 100 & micro ; g/mL de streptomycine et 5 & micro ; g/mL d’insuline humaine |
Références
- Zhang, D., Luo, G., Ding, X., Lu, C. Preclinical experimental models of drug metabolism and disposition in drug discovery and development. Acta Pharmaceutica Sinica B. 2 (6), 549-561 (2012).
- Hynds, R. E., Giangreco, A.
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Réimpressions et autorisations
