हमने आंत और लिवर ऑर्गेनॉइड के साथ एसिटामिनोफेन (एपीएपी) के लिए एक माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) को उजागर किया। यह लेख सांसदों में ऑर्गेनॉइड उत्पादन और एपीएपी फार्माकोकाइनेटिक और विषाक्त संपत्ति आकलन के तरीकों का वर्णन करता है। यह परिणामों को मान्य करने के लिए आवश्यक ऊतक कार्यक्षमता विश्लेषण का भी वर्णन करता है।
हाल ही में शुरू की गई माइक्रोफिजियोलॉजिकल सिस्टम (एमपीएस) मानव ऑर्गेनॉइड की खेती करने से दवा विकास प्रक्रिया के प्रीक्लिनिकल परीक्षण चरण में जानवरों की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करने की उम्मीद है क्योंकि वे आनुवंशिक रूप से मानव हैं और ऊतकों के बीच परस्पर क्रिया को फिर से लागू करते हैं । इस अध्ययन में, मानव आंतों की बाधा (Caco-2 और एचटी-29 कोशिकाओं की सह-संस्कृति द्वारा अनुकरणीय) और यकृत समकक्ष (विभेदित हेपार्ग कोशिकाओं और मानव हेपेटिक स्टेलेट कोशिकाओं से बने स्फेरॉइड द्वारा अनुकरणीय) को कुछ एसिटामिनोफेन (एपीएपी) फार्माकॉइनेटिक (पीके) और वैज्ञानिक गुणों का आकलन करने के लिए दो-अंग चिप (2-ओसी) माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस में एकीकृत किया गया था। सांसदों तीन विधानसभाओं था: आंत केवल 2-ओसी, जिगर केवल 2-ओसी, और आंत/जिगर 2-ओसी एक ही मीडिया के साथ दोनों ऑर्गेनॉइड perfusing । पीके आकलन के लिए, हमने इसे या तो आंतों की बाधा (मौखिक मार्ग की नकल) या मीडिया (नसों में मार्ग की नकल) पर क्रमशः 12 माइक्रोन और 2 माइक्रोनएम पर प्रशासित करने के बाद पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं पर मीडिया में एपीएपी को खुराक दी। मीडिया के नमूनों का विश्लेषण उत्क्रमित चरण के उच्च दबाव वाले तरल क्रोमेटोग्राफी (एचपीएलसी) द्वारा किया गया । जीन अभिव्यक्ति के लिए, टीईईआर मूल्यों के लिए, प्रोटीन अभिव्यक्ति और गतिविधि के लिए, और फिर एकत्र, तय, और रूपात्मक मूल्यांकनों के एक सेट को प्रस्तुत किया गया। एमटीटी तकनीक ने ऑर्गेनॉइड व्यवहार्यता का आकलन करने में अच्छा प्रदर्शन किया, लेकिन उच्च सामग्री विश्लेषण (एचसीए) एपीएपी उपचार के जवाब में बहुत जल्दी विषाक्त घटनाओं का पता लगाने में सक्षम थे। हमने सत्यापित किया कि मीडिया प्रवाह एपीएपी अवशोषण को काफी प्रभावित नहीं करता है जबकि यह यकृत समकक्ष कार्यक्षमता में काफी सुधार करता है। एपीएपी मानव आंतों के अवशोषण और हेपेटिक चयापचय को सांसदों में अनुकरण किया जा सकता है। एमपीएस डेटा और सिलिको मॉडलिंग के बीच सहयोग में इन विट्रो विधियों की पूर्वानुमेयता में सुधार करने और फार्माकोकाइनेटिक और विष विज्ञानी अध्ययनों में पशु मॉडल की तुलना में बेहतर सटीकता प्रदान करने की काफी क्षमता है।
जीनोमिक और प्रोटेओमिक मतभेदों के कारण, पशु मॉडल में कई मानव परिणामों के लिए सीमित भविष्य कहनेवाला मूल्य होता है। इसके अलावा, वे समय लेने वाली, महंगी और नैतिकता की दृष्टि से संदिग्ध1हैं । सांसदों एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है कि भविष्य कहनेवाला शक्ति में सुधार लाने और लागत और पूर्व नैदानिक परीक्षणों के साथ बिताए समय को कम करने के उद्देश्य है । वे मीडिया प्रवाह के तहत ऑर्गेनॉइड (अंगों की कृत्रिम मिमेटिक्स कार्यात्मक इकाइयों) की खेती करने वाले माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण हैं जो ऑर्गेनॉइड-ऑर्गेनॉइड संचार को बढ़ावा देते हैं। मानव कोशिकाओं से बने ऑर्गेनॉइड अनुवादात्मक प्रासंगिकता को बढ़ाते हैं2,3,4. सांसदों को पशु परीक्षणों से बेहतर प्रदर्शन करने की उम्मीद है क्योंकि वे आनुवंशिक रूप से मानव हैं और ऊतकों के बीच परस्पर क्रिया को फिर से शुरू करते हैं । जब पूरी तरह से कार्यात्मक, सांसदों अधिक सार्थक परिणाम प्रदान करेगा, उच्च गति और कम लागत और जोखिम4पर । कई समूहों के कई प्रयोजनों के लिए सांसदों को विकसित कर रहे हैं, विशेष रूप से रोग मॉडल दवा की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए ।
दवा की प्रभावकारिता और विषाक्तता 5 , 6 , 6 , 8 ,9,10,11,12के मूल्यांकन के लिए एक्सपोजर स्तर सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों मेंसेएक है । एमपीएस ऑर्गेनॉइड एकीकरण की अनुमति देता है जो प्रणालीगत एक्सपोजर का अनुकरण करता है और पारंपरिक 2डी मानव ऊतक संस्कृति की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करने की उम्मीद है। इस तकनीक से आंतों के अवशोषण और यकृत चयापचय4की भविष्यवाणी में काफी सुधार हो सकता है ।
आंत और यकृत के मानव समकक्ष मॉडल को एकीकृत करने वाला सांसद दवा जैव उपलब्धता और प्रणालीगत एक्सपोजर13, 14, 15में इन दोनों अंगों की केंद्रीय भूमिका को ध्यान मेंरखतेहुएएक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है। एपीएपी बिना किडनी के बिना किसी एमपीएस का अध्ययन करने के लिए एक आकर्षक दवा है क्योंकि इसका मेटाबोलाइजेशन मुख्य रूप से लिवर16,17द्वारा किया जाता है ।
2-ओसी एक दो-कक्ष माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस है जो माइक्रोचैनल16से जुड़े दो अलग-अलग मानव समकक्ष ऊतकों/ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए उपयुक्त है। एक दवा के इन विट्रो मानव मौखिक/नसों में प्रशासन का अनुकरण करने और एपीएपी फार्माकोकिनेटिक्स पर आंत और यकृत समकक्ष के बीच क्रॉस-टॉक के प्रभावों का आकलन करने के लिए, ऑर्गेनॉइड कार्यक्षमता और व्यवहार्यता के अलावा, तीन अलग-अलग सांसदों की विधानसभाओं का प्रदर्शन किया गया: (1) एक “आंत 2-ओसी एमपीएस” जिसमें एक संस्कृति सम्मिलित एक संस्कृति में आधारित आंत के समकक्ष शामिल थे, जिसमें 2-ओसी डिवाइस में एकीकृत कैको-2 + एचटी-29 कोशिकाएं coculture होती हैं; (2) एक “जिगर 2-ओसी सांसदों” हेपआरजी + HHSteC (मानव हेपेटिक स्टेलेट सेल) 2-ओसी डिवाइस में एकीकृत से बने जिगर स्फेरॉइड के शामिल; और (3) एक “आंत/जिगर 2-ओसी सांसदों” एक उपकरण डिब्बे में आंत समकक्ष के शामिल microfluidic चैनलों के माध्यम से मीडिया प्रवाह द्वारा दूसरे में जिगर समकक्ष के साथ संवाद ।
कोशिका व्यवहार्यता और कार्यक्षमताओं18, 19,20पर यांत्रिक उत्तेजनाओं (संपीड़न, खींच, और कतरनी) के प्रभाव के कारण स्थिर (कोई प्रवाह नहीं) और गतिशील (प्रवाह के साथ) स्थितियों के तहत सभी परख किए गए थे। वर्तमान लेख APAP मौखिक/नसों में प्रशासन अनुकरण और संबंधित अवशोषण/चयापचय और विषाक्त विश्लेषण के लिए 2-ओसी मानव आंत और जिगर समकक्ष मॉडल युक्त सांसदों में प्रोटोकॉल का वर्णन करता है ।
खोजी नई दवाओं के फार्माकोलॉजिक गुणों का सटीक और विश्वसनीय आकलन निम्नलिखित विकास चरणों में जोखिम को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। सांसदों एक अपेक्षाकृत नई तकनीक है, कि भविष्य कहनेवाला शक्ति में सुधार ?…
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ क्रिस्टी गुगुएन-गुइलोजो, यूनिट ५२२ INSERM में डॉ फिलिप ग्रिपर और जैविक सामग्री (Hepa आरजी कोशिकाओं) के उपयोग के लिए यूनिट २७१ INSERM में डॉ क्रिश्चियन ट्रेपो के लिए धन्यवाद और फिर हमारे लिए उपलब्ध बनाने के लिए अकादमिक अनुसंधान करने के लिए ।
1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
Cacodylate buffer | |||
Cell culture flasks | Sarstedt | ||
Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
Cryostat | Leica | CM1950 | |
DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
Ethanol | Synth | ||
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
Hematoxylin & Eosin | |||
HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
Isopropanol | Merck | 278475 | |
Karnovsky’s fixative | |||
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
Microscope | Leica | DMi4000 | |
Microtome | Leica | RM2245 | |
Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
MX3000P system | Agilent Technologies | ||
Neubauer chamber | Counting cells | ||
Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
Primers | RT-qPCR | ||
PVDF membrane | BioRad | ||
PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
Vectashield plus DAPI mounting media | |||
White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
Wide-bore tips | |||
Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |