Un sistema microfisiológico intestinal/hepático para la evaluación farmacocinética y toxicológica de fármacos
Summary
Hemos expuesto un sistema microfisiológico (MPS) con organoides intestinales y hepáticos al paracetamol (APAP). Este artículo describe los métodos para la producción de organoides y las evaluaciones de propiedades farmacocinéticas y toxicológicas APAP en el MPS. También describe los análisis de funcionalidad tisular necesarios para validar los resultados.
Abstract
Se espera que los sistemas microfisiológicos (MPS) que cultivan organoides humanos recientemente introducidos funcionen mejor que los animales en la fase de pruebas preclínicas del proceso de desarrollo de fármacos porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. En este estudio, la barrera intestinal humana (emulada por un co-cultivo de células Caco-2 y HT-29) y el equivalente hepático (emulado por esferoides hechos de células HepaRG diferenciadas y células estelares hepáticas humanas) se integraron en un dispositivo microfluídico chip de dos órganos (2-OC) para evaluar algunas propiedades farmacocinéticas (PK) y toxicológicas de paracetamol (APAP). El MPS tenía tres conjuntos: Intestina sólo 2-OC, Hígado sólo 2-OC, e Intestino/Hígado 2-OC con el mismo medio perfundiendo ambos organoides. Para las evaluaciones PK, dosificamos el APAP en los medios en los puntos de tiempo preestablecidos después de administrarlo ya sea sobre la barrera intestinal (emulando la vía oral) o en el medio (emulando la vía intravenosa), a 12 m y 2 M respectivamente. Las muestras de medios se analizaron mediante cromatografía líquida de alta presión (HPLC) en fase inversa. Los organoides se analizaron para la expresión génica, para los valores TEER, para la expresión y la actividad de las proteínas, y luego se recogieron, fijaron y sometieron a un conjunto de evaluaciones morfológicas. La técnica de MTT tuvo un buen desempeño en la evaluación de la viabilidad organoides, pero los análisis de alto contenido (HCA) fueron capaces de detectar eventos tóxicos muy tempranos en respuesta al tratamiento APAP. Verificamos que el flujo de medios no afecta significativamente la absorción APAP mientras que mejora significativamente la funcionalidad equivalente del hígado. La absorción intestinal humana APAP y el metabolismo hepático podrían emularse en el MPS. La asociación entre los datos MPS y el modelado en silicio tiene un gran potencial para mejorar la previsibilidad de los métodos in vitro y proporcionar una mayor precisión que los modelos animales en estudios farmacocinéticos y toxicológicos.
Introduction
Debido a las diferencias genómicas y proteómicas, los modelos animales tienen un valor predictivo limitado para varios resultados humanos. Además, son lentos, caros y éticamente cuestionables1. MPS es una tecnología relativamente nueva que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Son dispositivos microfluídicos que cultivan organoides (unidades funcionales de órganos miméticos artificiales) bajo un flujo de medios que promueve la comunicación organoide-organoides. Los organoides hechos de células humanas aumentan larelevanciatraslacional 2,3,4. Se espera que el MPS funcione mejor que las pruebas en animales porque son genéticamente humanos y recapitulan la interacción entre los tejidos. Cuando es completamente funcional, el MPS proporcionará resultados más significativos, a mayor velocidad y menores costos y riesgos4. Muchos grupos están desarrollando MPS para varios propósitos, especialmente modelos de enfermedades para probar la eficacia de los medicamentos.
El nivel de exposición es uno de los parámetros más críticos para evaluar la eficacia y toxicidad de los medicamentos5,6,7,8,9,10,11,12. MPS permite la integración organoidea que emula la exposición sistémica y se espera que funcione mejor que el cultivo tradicional de tejido humano 2D. Esta tecnología puede mejorar significativamente la predicción de la absorción intestinal compuesta y el metabolismo hepático4.
Un MPS que integra el modelo humano equivalente del intestino y el hígado es un buen punto de partida, teniendo en cuenta el papel central de estos dos órganos en la biodisponibilidad de fármacos y la exposición sistémica13,14,15. APAP es un fármaco atractivo para el estudio de un MPS sin un equivalente renal porque su metabolización se realiza principalmente por el hígado16,17.
El 2-OC es un dispositivo microfluídico de dos cámaras adecuado para el cultivo de dos tejidos/organoides equivalentes humanos diferentes interconectados por microcanales16. Con el fin de emular una administración oral/intravenosa humana in vitro de un medicamento y evaluar los efectos de la conversación cruzada entre los equivalentes del intestino y del hígado en la farmacocinética APAP, además de la funcionalidad y viabilidad de los organoides, se realizaron tres conjuntos MPS diferentes: (1) un “Empentí 2-OC MPS” compuesto por un equivalente intestinal basado en un inserto de cultivo que contiene una cocultura de células Caco-2 + HT-29, integrada en el dispositivo 2-OC; (2) un “Liver 2-OC MPS” compuesto por esferoides hepáticos hechos de HepaRG + HHSteC (Células Estelares Hepáticas Humanas) integrados en el dispositivo 2-OC; y (3) un “Empo del Hígado 2-OC MPS” compuesto por el equivalente del intestino en un compartimiento del dispositivo que se comunica con el equivalente hepático en el otro por el flujo de medios a través de los canales microfluídicos.
Todos los ensayos se realizaron en condiciones estáticas (sin flujo) y dinámicas (con flujo) debido al impacto de los estímulos mecánicos (compresión, estiramiento y cizallamiento) en la viabilidad y funcionalidades de la célula18,19,20. El presente artículo describe el protocolo para la emulación de administración oral/intravenosa APAP y los respectivos análisis de absorción/metabolismo y toxicológicos en el MPS 2-OC que contiene modelos equivalentes de intestino humano y hígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
La evaluación precisa y fiable de las propiedades farmacológicas de los nuevos fármacos de investigación es fundamental para reducir el riesgo en los siguientes pasos de desarrollo. El MPS es una tecnología relativamente nueva, que tiene como objetivo mejorar el poder predictivo y reducir los costos y el tiempo invertido con las pruebas preclínicas. Nuestro grupo está avanzando en la evaluación de las propiedades farmacocinéticas y toxicológicas que se necesitan principalmente para la optimización del plomo. T…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. Christie Guguen-Guillouzo, al Dr. Philippe Gripon en la Unidad 522 INSERM y al Dr. Christian Trepo en la Unidad 271 INSERM por el uso del Material Biológico (células Hepa RG) y por ponernos a nuestra disposición con el fin de realizar la investigación académica.
Materials
| 1x DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14190235 | No calcium, no magnesium |
| 2-OC | TissUse GmbH | Two-organ chip | |
| 384-well Spheroid Microplate | Corning | 3830 | Black/Clear, Round Bottom, Ultra-Low Attachment |
| 4% Paraformaldehyde | Use to fix cell | ||
| Acetaminophen | Sigma Aldrich | A7085 | Use to MPS assays |
| Acetonitrile | Tedia | Used to perform HPLC | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | confocal experiment | |
| Ammonium acetate | Sigma Aldrich | Used to perform HPLC | |
| Caco-2 cells | Sigma Aldrich | 86010202 | |
| Cacodylate buffer | |||
| Cell culture flasks | Sarstedt | ||
| Confocal Fluorescence microscope | Leica | DMI6000 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher Scientific | 12800017 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 100 units per mL penicillin, 100 µg/mL streptomycin, and 1% non-essential amino acids |
| DMSO | Sigma Aldrich | D4540 | Add 2% to HepaRG media |
| Ethanol | Synth | ||
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12657029 | |
| Freezing medium OCT | Tissue-Tek | Tissue-Tek® O.C.T.™ Compound is a formulation of watersoluble glycols and resins, providing a convenient specimen matrix for cryostat sectioning at temperatures of -10°C and below. | |
| Hematoxylin & Eosin | |||
| HepaRG cells | Biopredic International | HPR101 | Undifferentiated cells |
| HHSTeC | ScienCell Research Laboratories | 5300 | Cells and all culture supplements |
| Hoechst 33342 | HCA experiments | ||
| HT-29 cells | Sigma Aldrich | 85061109 | |
| Human Insulin | Invitrogen – Thermo Fisher Scientific | 12585014 | |
| Hydrocortisone | Sigma Aldrich | H0888 | |
| Isopropanol | Merck | 278475 | |
| Karnovsky’s fixative | |||
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | A2916801 | |
| Luna C18 guard column SS | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Microscope | Leica | DMi4000 | |
| Microtome | Leica | RM2245 | |
| Millicell 0.4 µm pore size inserts | Merck | PIHP01250 | |
| Millicell ERS-2 meter | Merck | MERS00002 | Used to TEER measurement |
| MitoTracker Deep Red | HCA experiments | ||
| MTT | Thermo Fisher Scientific | M6494 | |
| MX3000P system | Agilent Technologies | ||
| Neubauer chamber | Counting cells | ||
| Operetta High Content Imaging System | Perkin Elmer | Used to perform HCA | |
| P450-Glo CYP3A4 Assay with Luciferin-IPA | Promega | Cat.# V9001 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15070063 | Cell culture |
| Permount | Thermo Fisher Scientific | Histology | |
| Primers | RT-qPCR | ||
| PVDF membrane | BioRad | ||
| PVDF Syringe filter | 0.22 μm pore size | ||
| Reversed-phase Luna C18 column | Phenomenex | Used to perform HPLC | |
| Shaker (IKA VXR Basic Vibrax) | IKA Works GmbH & Co | 2819000 | Used for spheroids to improve MTT assay |
| Stellate Cell Media (STeC CM) | ScienCell | 5301 | Add STeC CM supplements |
| SuperScriptIITM Reverse Transcriptase | Thermo Fisher Scientific | ||
| SYBR Green PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | ||
| TRizol TM reagent | Thermo Fisher Scientific | Trizol is a monophasic solution of phenol and guanidine isothiocyanate. | |
| Trypsin/EDTA solution | Thermo Fisher Scientific | R001100 | |
| Ultra-low-attachment plates | Corning | CLS3471-24EA | 6 wells |
| Vectashield plus DAPI mounting media | |||
| White Opaque 96-well Microplate | PerkinHelmer | ||
| Wide-bore tips | |||
| Williams E | Pan Biotech | P04-29510 | Add supplements: 10% fetal bovine serum, 2 mM L-glutamine, 100 units per ml penicillin, 100 µg/mL streptomycin and 5 µg/mL human insulin |
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