Generatie van heterogene drugs gradiënten over kanker populaties op een Microfluïdische evolution Accelerator voor real-time observatie
Summary
We presenteren een microfluïdische Cancer-on-chip-model, de “Evolution Accelerator”-technologie, die een controleerbaar platform biedt voor langdurige realtime kwantitatieve studies van kanker dynamiek binnen goed gedefinieerde omgevingscondities op de eencellige Niveau. Deze technologie wordt verwacht te werken als een in vitro model voor fundamenteel onderzoek of pre-klinische ontwikkeling van de drug.
Abstract
Conventionele celcultuur blijft het meest gebruikte preklinische model, ondanks het bewezen beperkte vermogen om klinische resultaten bij kanker te voorspellen. Microfluïdische kanker-op-chip-modellen zijn voorgesteld om de kloof tussen de oververeenvoudigde conventionele 2D-culturen en meer gecompliceerde diermodellen te overbruggen, die een beperkt vermogen hebben om betrouwbare en reproduceerbaar kwantitatieve resultaten te produceren. Hier presenteren we een microfluïdische Cancer-on-chip-model dat belangrijke componenten van een complexe tumor micro-omgeving op een uitgebreide manier reproduceert, maar is eenvoudig genoeg om robuuste kwantitatieve beschrijvingen van de kanker dynamiek te bieden. Deze microfluïdische kanker-op-chip model, de “Evolution Accelerator,” breekt een grote populatie van kankercellen in een onderling verbonden array van tumor micro-omgevingen terwijl het genereren van een heterogene chemotherapeutische stress landschap. De progressie en de evolutionaire dynamiek van kanker in reactie op de gradiënt van de drug kunnen weken in real time worden gemonitord, en talrijke downstreamexperimenten kunnen aanvullend worden uitgevoerd op de timelapse-beelden die door de loop van de experimenten zijn genomen.
Introduction
Kanker wordt steeds meer erkend als een complex ecosysteem dat niet alleen afhangt van de aanhoudende disregulatie van gemuleerde celpopulaties, maar ook van vitale interacties tussen kankercellen en de host-micro omgeving. In deze zin evolueert kanker op een adaptief landschap dat zich manifesteert door een combinatie van factoren, waaronder een heterogene tumor micro omgeving en overspraak met een verscheidenheid aan gastcellen, die allemaal selectieve druk leveren voor verdere genetische of epigenetische veranderingen1,2,3. In de context van solide tumoren draagt een ongelijke verdeling van chemotherapeutica en andere middelen gradiënten bij aan hun moleculaire heterogeniteit en kan een rol spelen bij de ontwikkeling van de resistentie tegen geneesmiddelen, verhoogde angiogenese tot bepaalde tumor subpopulaties, en zelfs metastase4,5,6. Conventionele in vitro 2D celkweek studies, terwijl het bezitten van grootschalige, handige experimentele capaciteit, biedt mean-veld, uniforme en vaste voorwaarden, vaak ontbreekt de precieze ruimtelijke en temporele milieucontrole nodig om echt emuleren in vivo tumor dynamiek. Er is dus behoefte aan meer representatieve ex vivo-modellen om de tumor micro te reproduceren voorafgaand aan diermodellen in de pijplijn ontwikkeling van de geneesmiddelen, zodat een betere voorspelling van kanker progressie en reacties op drugs binnen dynamische stress Landschappen. Microfluïdica is voorgesteld om de kloof tussen 2D celkweek studies en meer complexe in vivo dierstudies die mogelijk niet in staat zijn om controleerbaar kwantitatieve studies7,8,9te overbruggen.
Een ideaal in vitro systeem om de celdynamiek van kanker te karakteriseren, moet de mogelijkheid bezitten om een heterogene micro omgeving te genereren om de adaptieve cellulaire reacties die kunnen plaatsvinden in een tumor na te bootsen, en om de observatie van deze dynamiek op een resolutie met één cel. In dit artikel beschrijven we een microfluïdisch celcultuurplatform, een PDMS-gebaseerd apparaat dat de “Evolution Accelerator” (EA) wordt genoemd, dat parallelle in vitro studies van kanker celdynamica op cellulaire resolutie mogelijk maakt met real-time data-acquisitie over de loop van weken, terwijl stabiel hellingen van stress in het cultuurlandschap behouden blijft. Het ontwerp van dit platform is gebaseerd op ons vorige werk, waarin de evolutionaire dynamiek van organismen in een metaopulatie kan worden versneld10,11. Specifiek, in een groep van ruimtelijk gescheiden populaties die op een bepaald niveau interageren, bij blootstelling aan een heterogeen stress landschap, kunnen de meest geschikte soorten sneller domineren in een lokale populatie in vergelijking met die van een grote uniforme populatie. De voordelige soorten migreren vervolgens naar naburige micro habitats op zoek naar middelen en ruimte, en domineren uiteindelijk de hele bevolking. Zoals weergegeven in Figuur 1, is het patroon van de microfluïdische EA-chip samengesteld uit (i) een paar serpentine kanalen die nieuwe media circulatie bieden en vaste grenswaarden voor chemische diffusie construeren, en (II) het zeshoekige celkweek gebied dat bestaat uit 109 verbonden zeshoekige en 24 half-zeshoekige kamers in het midden, die lijken op een honingraatstructuur. De chip is 100 μm diep. Media kanalen en celcultuurregio zijn verbonden met kleine spleten (ongeveer 15 μm breed), die directe mediastroom en de resulterende shear stress in het celkweek gebied voorkomen, maar toch chemicaliën kunnen verspreiden door kleine spleten en voedingsstoffen uitwisselen, metabole afvalstoffen, enz. De aanmaak van chemische gradiënten wordt aangetoond in Figuur 1B, waarbij één media kanaal 0,1 mm fluoresceïne bevat, terwijl het andere kanaal vrij is van fluoresceïne. Cellen worden gekweekt op een gasdoorlatbaar membraan, ingekapseld door de microstructuren door de positieve rugdruk op het membraan tegen de chip. De componenten van de Apparaathouder worden geïllustreerd in Figuur 2, en de experimentele opstelling wordt geïllustreerd in Figuur 3, waar de cultuur wordt gehandhaafd op een omgekeerde Microscoop bij 37 °c, met boven 85% relatieve vochtigheid, en geconditioneerd onder normoxia-gassamenstelling.
Dit systeem biedt gedetailleerde observatie van gelokaliseerde cellulaire interacties via brightfield en fluorescerende kanalen en zorgt voor ruimtelijk opgeloste downstream testen zoals immunofluorescentie, Western Blot of massaspectrometrie. We hebben eerder gedemonstreerd als een proof-of-principe van deze microfluïdische kanker-op-chip model op de lange termijn co-cultuur van epitheliale en mesenchymale PC3 prostaatkanker cellen12 evenals de opkomst van de drug-resistentie polyploïde reus kankercellen met behulp van de epitheliale PC3 cellijn13. Terwijl we de toepassing van dit platform om te begrijpen van de spatiotemporele dynamiek van epitheliale PC3 en mesenchymale prostaatkanker cellen onder een spannings gradiënt van docetaxel presenteren, kan het microfluïdische systeem gemakkelijk worden toegepast op elke combinatie van cellijnen en middelen (d.w.z. drugs, nutriënten, zuurstof) gradiënten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Conventionele celcultuur werd bijna een eeuw geleden ontwikkeld en blijft het meest gebruikte preklinische model in biomedisch onderzoek, ondanks het bewezen beperkte vermogen om klinische resultaten in kanker17te voorspellen. Diermodellen bieden de hoogste fysiologische relevantie en redelijke genetische gelijkenis met de mens, maar hebben al lang erkend aanzienlijke beperkingen te hebben in het voorspellen van menselijke resultaten18. Onder alle bestaande preklinische mod…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NSF PHY-1659940.
Materials
| 10 mL BD Luer-Lok tip syringes | BD | 14-823-16E | |
| Antibiotic-Antimycotic | Sigma-Aldrich | A5955 | 1x anti-anti |
| AZ 300 MIF | Merck KGaA | 18441123163 | Photoresist developer |
| AZ1518 | Merck KGaA | AZ1518 | Photoresist |
| AZ4330 | Merck KGaA | AZ4330 | Photoresist |
| Cr Chromium Etchant | Sigma-Aldrich | 651826 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Life Technologies Corporation | 10437028 | |
| Heidelberg DWL 66+ laserwriter | Heidelberg Instruments | DWL66+ | Writing photomask |
| Hexamethyldisilazane (HMDS) | Sigma-Aldrich | 379212 | For photoresist adhesion enhancement |
| Hollow steel pins | New England Small Tube | NE-1300-01 | .025 OD .017 ID x .500 long / type 304 WD fullhard |
| ibidi Heating System, Multi-Well Plates, K-Frame | ibidi | 10929 | On-stage incubator |
| Luer-Lok 23 G dispensing needle | McMaster-Carr | 75165A684 | To connect syringes and tubings |
| Lumox dish 35 | Sarstedt | 94.6077.331 | Gas-permeable cell culture dish |
| Microposit Remover 1165 | Dow Electronic Materials | Microposit Remover 1165 | Photoresist stripper |
| Microseal B Adhesive Sealer | Bio-Rad Laboratories | MSB1001 | Adhesive sealer |
| O-Ring (for Lumox plate sealing) | McMaster-Carr | 9452K114 | Dash No. 27; 1-5/16" ID x 1-7/16" OD; Duro 70 |
| O-Ring (for bottom glass window sealing) | McMaster-Carr | 9452K74 | Dash No. 20; 7/8" ID x 1" OD; Duro 70 |
| Plasma-Preen Plasma Cleaning/Etching System | Plasmatic Systems, Inc | Plasma-Preen | Oxygen plasma system |
| RPMI 1640 | Life Technologies Corporation | 11875-093 | |
| Samco RIE800iPB DRIE | Samco | RIE800iPB | Deep reactive-ion etching system |
| Suss MA6 mask aligner | SUSS MicroTec | MA6 | Mask aligner |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer | Fisher Scientific | NC9285739 | PDMS elastomer |
| TePla M4L plasma etcher | PVA TePla | M4L | Plasma etcher |
| Trichloro-1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl-silane (PFOTS) | Sigma-Aldrich | 448931 | For silicon wafer silanization |
| Tygon microbore tube (0.020" x 0.060"OD) | Cole-Parmer | EW-06419-01 | Tubings for media delivery |
References
- Meacham, C. E., Morrison, S. J. Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity. Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Lambert, G., et al. An analogy between the evolution of drug resistance in bacterial communities and malignant tissues. Nature Reviews Cancer. 11 (5), 375-382 (2011).
- Tannock, I. F., Lee, C. M., Tunggal, J. K., Cowan, D. S., Egorin, M. J. Limited penetration of anticancer drugs through tumor tissue: a potential cause of resistance of solid tumors to chemotherapy. Clinical Cancer Research. 8 (3), 878-884 (2002).
- Grantab, R. H., Tannock, I. F. Penetration of anticancer drugs through tumour tissue as a function of cellular packing density and interstitial fluid pressure and its modification by bortezomib. BMC Cancer. 12, 214 (2012).
- Fu, F., Nowak, M. A., Bonhoeffer, S. Spatial Heterogeneity in Drug Concentrations Can Facilitate the Emergence of Resistance to Cancer Therapy. PLoS Computational Biology. 11 (3), e1004142 (2015).
- Bogorad, M. I., et al. In vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15 (22), 4242-4255 (2015).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Caballero, D., Blackburn, S. M., De Pablo, M., Samitier, J., Albertazzi, L. Tumour-vessel-on-a-chip models for drug delivery. Lab on a Chip. 17 (22), 3760-3771 (2017).
- Zhang, Q., et al. Acceleration of emergence of bacterial antibiotic resistance in connected microenvironments. Science. 333 (6050), 1764-1767 (2011).
- Wu, A., et al. Ancient hot and cold genes and chemotherapy resistance emergence. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (33), 10467-10472 (2015).
- Lin, K. C., et al. Epithelial and mesenchymal prostate cancer cell population dynamics on a complex drug landscape. Convergent Science Physical Oncology. 3 (4), 045001 (2017).
- Lin, K. C., et al. The role of heterogeneous environment and docetaxel gradient in the emergence of polyploid, mesenchymal and resistant prostate cancer cells. Clinical & Experimental Metastasis. 36 (2), 97-108 (2019).
- Roca, H., et al. Transcription factors OVOL1 and OVOL2 induce the mesenchymal to epithelial transition in human cancer. PloS One. 8 (10), e76773 (2013).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Tinevez, J. Y., et al. Trackmate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
- Caballero, D., et al. Organ-on-chip models of cancer metastasis for future personalized medicine: From chip to the patient. Biomaterials. 149, 98-115 (2017).
- Akhtar, A. The flaws and human harms of animal experimentation. Cambridge Quarterly of Healthcare Ethics. 24 (4), 407-419 (2015).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nature Reviews Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Bogorad, M. I., DeStefano, J., Karlsson, J., Wong, A. D., Gerecht, S., Searson, P. C. Review: in vitro microvessel models. Lab on a Chip. 15, 4242-4255 (2015).
- Zañudo, J. G. T., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002 (2019).
- Morris, R. J., et al. Bacterial population solitary waves can defeat rings of funnels. New Journal of Physics. 19 (3), 035002 (2017).
