حل المياه والبروتينات والدهون من في فيفو الأطياف رامان البؤرية من الطبقة القرنية من خلال نهج قياس كيميائي
Summary
هنا، نقدم بروتوكول لجمع أطياف رامان البؤرية من البشر في الدراسات السريرية جنبا إلى جنب مع النهج الكيميائية للإزالة الطيفية الخارجية واستخراج لاحق ة من السمات الرئيسية.
Abstract
تطوير هذا في الجسم الحي البؤري رامان طريقة مطيافية تمكن من القياس المباشر للمياه والبروتينات والدهون مع دقة عمق في البشر. هذه المعلومات مهمة جدا للأمراض المتصلة بالبشرة وتميز أداء منتجات العناية بالبشرة. ويوضح هذا البروتوكول طريقة لجمع أطياف رامان البؤرية والتحليل اللاحق لمجموعة البيانات الطيفية التي تستفيد من المقاييس الكيميائية. والهدف من هذه الطريقة هو وضع بروتوكول موحد لجمع البيانات وتوفير التوجيه العام لتحليل البيانات. المعالجة المسبقة (على سبيل المثال، إزالة الأطياف الخارجية) هي خطوة حاسمة عند معالجة مجموعات البيانات الكبيرة من الدراسات السريرية. وعلى سبيل المثال، نقدم إرشادات تستند إلى المعرفة المسبقة لمجموعة البيانات لتحديد أنواع القيم الخارجية ووضع استراتيجيات محددة لإزالتها. يتم إجراء تحليل مكون رئيسي، ويتم مقارنة أطياف التحميل بالأطياف من المواد المرجعية لتحديد عدد المكونات المستخدمة في التحليل النهائي لدقة منحنى المتغيرات المتعددة (MCR). وقد نجح هذا النهج في استخراج معلومات ذات مغزى من مجموعة بيانات طيفية كبيرة.
Introduction
في الدراسات السريرية، في الجسم الحي البؤري رامان مطياف أظهرت قدرتها الفريدة لتحديد سمك القرنية الطبقة ومحتوى المياه1،2،3،4،وتتبع اختراق المواد النشطة تطبق موضعيا على الجلد5،6. كنهج غير الغازية، يكشف مطياف رامان البؤري الإشارات الجزيئية على أساس أوضاع الاهتزاز. وبالتالي، لا حاجة لوضع العلامات7. في الجسم الحي البؤري رامان مطيافييوفر المعلومات الكيميائية مع دقة عمق استنادا إلى الطبيعة البؤرية لهذه التقنية. هذه المعلومات التي تعتمد على العمق مفيدة جدا في دراسة آثار منتجات العناية بالبشرة4،8، الشيخوخة9،10، التغيرات الموسمية3، فضلا عن الأمراض وظيفة حاجز الجلد ، مثل التهاب الجلد التأتبي11،12. هناك الكثير من المعلومات في منطقة التردد العالي من مطياف رامان البؤري (2500-4000 سم-1)،حيث تنتج المياه قمم متميزة في المنطقة بين 3,250-3,550 سم-1. ومع ذلك، فإن قمم رامان من البروتينات والدهون، والتي تتركز بين ما يقرب من 2800-3000 سم-1،تتداخل مع بعضها البعض لأن الإشارات تنتج أساسا من الميثيلين (-CH2-) والميثيل (-CH3)مجموعات13 . وتمثل هذه المعلومات المتراكبة تحديا تقنيا عند الحصول على كميات نسبية من الأنواع الجزيئية الفردية. وقد استخدمت الذروة المناسب14،15 وانتقائية موقف الذروة12،16 النهج لحل هذا التحدي. ومع ذلك، فإنه من الصعب على هذه الطرق المستندة إلى الذروة واحدة لاستخراج معلومات المكون النقي لأن قمم رامان متعددة من نفس المكون تغيير في نفس الوقت17. في المنشور الأخير18، اقترح نهج MCR لتوضيح المعلومات المكون النقي. باستخدام هذا النهج، تم استخراج ثلاثة مكونات (الماء والبروتينات والدهون) من مجموعة بيانات مطيافية كبيرة في الجسم الحي.
تنفيذ الدراسات السريرية الكبيرة يمكن أن تكون صعبة على الأفراد جمع في البيانات الطيفية الجسم الحي. وفي بعض الحالات، يمكن أن يتطلب الاكتساب الطيفي معدات تشغيل لعدة ساعات في اليوم، ويمكن أن تمتد الدراسة إلى أسابيع أو أشهر. وفي ظل هذه الظروف، يمكن أن يتم توليد البيانات الطيفية من قبل مشغلي المعدات الذين يفتقرون إلى الخبرة التقنية لتحديد واستبعاد وتصحيح جميع مصادر القطع الأثرية الطيفية. وقد تحتوي مجموعة البيانات الناتجة على جزء صغير من القيم الخارجية الطيفية التي يلزم تحديدها واستبعادها من البيانات قبل التحليل. توضح هذه الورقة بالتفصيل عملية تحليل قياس كيميائي “لتنظيف” مجموعة بيانات رامان السريرية قبل تحليل البيانات مع MCR. ولإزالة القيم الخارجية بنجاح، يلزم تحديد أنواع القيم الخارجية والسبب المحتمل لتوليد الأطياف الخارجية. ثم، يمكن تطوير نهج محدد لإزالة القيم الخارجية المستهدفة. ويتطلب ذلك معرفة مسبقة بمجموعة البيانات، بما في ذلك فهم مفصل لعملية توليد البيانات وتصميم الدراسة. في مجموعة البيانات هذه، فإن غالبية القيم الخارجية هي أطياف منخفضة من الإشارة إلى الضوضاء وتنشأ في المقام الأول من 1) الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد (6,208 من أصل 30,862)، و 2) مساهمة قوية في الطيف من ضوء غرفة الفلورسنت (67 من أصل 30,862). الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد تنتج استجابة رامان ضعيفة، كما يقترب نقطة الاتصال الليزر سطح الجلد، ومعظمها في نافذة الصك تحت الجلد. يتم إنشاء Spectra مع مساهمة قوية من ضوء غرفة الفلورسنت بسبب إما خطأ مشغل الصك أو حركة الموضوع، والتي تنتج حالة حيث لا يتم تغطية إطار جمع رامان البؤري ة بالكامل من قبل موقع الجسم للموضوع. وعلى الرغم من أنه يمكن تحديد هذه الأنواع من القطع الأثرية الطيفية ومعالجتها أثناء اكتساب الطيفية من قبل خبير مطيافي وقت الحصول على البيانات، فقد صدرت تعليمات لمشغلي الأجهزة المدربين المناوّقين المناوّقين في هذه الدراسة بجمع جميع البيانات ما لم يكن هناك ولوحظ فشل كارثي. وتدرج مهمة تحديد واستبعاد القيم الخارجية في بروتوكول تحليل البيانات. وقد وضع البروتوكول المقدم لمواجهة هذا التحدي. لمعالجة الأطياف المنخفضة للإشارة إلى الضوضاء فوق سطح الجلد، يجب تحديد موقع سطح الجلد أولاً للسماح بإزالة الأطياف التي تم جمعها فوق سطح الجلد. يتم تعريف موقع سطح الجلد على أنه العمق حيث تكون نقطة الاتصال ليزر رامان نصف في الجلد ونصف من الجلد كما هو موضح في الشكل التكميلي 1. بعد إزالة الأطياف المنخفضة من الإشارة إلى الضوضاء، يتم تنفيذ تحليل مكون رئيسي (PCA) لاستخراج العامل الذي تهيمن عليه قمم ضوء غرفة الفلورسنت. تتم إزالة هذه القيم الخارجية استناداً إلى قيمة النتيجة للعامل المقابل.
يوفر هذا البروتوكول معلومات مفصلة عن كيفية تحديد ستة مكونات رئيسية في عملية MCR. ويتم ذلك من خلال تحليل الأنيكل الخماسي الكلور متبوعاً بمقارنة الشكل الطيفي بين عمليات التحميل للنماذج التي يتم إنشاؤها بعدد مختلف من المكونات الرئيسية. كما أن العملية التجريبية لجمع البيانات من المواد المرجعية فضلا عن المواضيع البشرية موضحة بالتفصيل أيضا.
Protocol
Representative Results
Discussion
أثناء جمع البيانات، كما هو موضح في القسمين 2 و3 من البروتوكول، تم جمع كل ملف عمق في منطقة مع اتصال بين نافذة الصك والجلد من خلال العثور على المناطق الداكنة من الصور المجهرية التي تم تسليط الضوء عليها في الدوائر الحمراء في الشكل 2جيم وبمجرد تحديد هذه المناطق، كان من …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويقر المؤلفون إلى حد كبير بالدعم المالي المقدم من قسم الرعاية التحليلية والتطهير الشخصي للوظائف المؤسسية. ونود أن نعرب عن امتناننا للمديرين المعاوبين التحليليين السيدة ياسمين وانغ والدكتور روب غاردنر على توجيههم ودعمهم، والسيدة لي يانغ على مساعدتها في جمع البيانات.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
