Oplossen van water, eiwitten en lipiden uit in vivo Confocale Raman spectra van stratum corneum door middel van een chemometrische benadering
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het verzamelen van Confocale Raman spectra van menselijke proefpersonen in klinische studies gecombineerd met chemometrische benaderingen voor spectrale uitschieter verwijdering en de daaropvolgende extractie van belangrijke functies.
Abstract
Ontwikkeling van deze in vivo Confocale Raman spectroscopische methode maakt de directe meting van water, eiwitten en lipiden met diepte resolutie bij menselijke proefpersonen mogelijk. Deze informatie is zeer belangrijk voor huid-gerelateerde ziekten en het karakteriseren van de prestaties van huidverzorgingsproducten. Dit protocol illustreert een methode voor Confocale Raman spectra Collection en de daaropvolgende analyse van de spectrale gegevensset, gebruikmakend van Chemometrie. Het doel van deze methode is het opstellen van een standaardprotocol voor het verzamelen van gegevens en het bieden van algemene richtlijnen voor gegevensanalyse. Voor verwerking (bijvoorbeeld het verwijderen van uitschieters Spectra) is een kritieke stap bij het verwerken van grote gegevenssets uit klinische studies. Als voorbeeld bieden we richtlijnen op basis van voorafgaande kennis van een gegevensset om de typen uitschieters te identificeren en specifieke strategieën te ontwikkelen om ze te verwijderen. Er wordt een hoofdcomponent analyse uitgevoerd en de laad spectra worden vergeleken met Spectra uit referentiematerialen om het aantal componenten te selecteren dat wordt gebruikt in de uiteindelijke analyse van de multivariate curve Resolution (MCR). Deze aanpak is succesvol voor het extraheren van zinvolle informatie uit een grote spectrale gegevensset.
Introduction
In klinische studies heeft Confocale Raman-spectroscopie in vivo zijn unieke vermogen aangetoond voor het bepalen van de dikte van stratum corneum en het watergehalte1,2,3,4en het volgen van de penetratie van actieve materialen die topisch op de huid worden aangebracht,5,6. Als een niet-invasieve aanpak detecteert Confocale Raman-spectroscopie moleculaire signalen op basis van vibrationele modi. Dus, labeling is niet nodig7. In vivo Confocale Raman-spectroscopie biedt chemische informatie met diepte resolutie op basis van het confocale karakter van de techniek. Deze diepte afhankelijke informatie is zeer nuttig bij het bestuderen van de effecten van huidverzorgingsproducten4,8, veroudering9,10, seizoensgebonden veranderingen3, evenals huidbarrière functie ziekten, zoals atopische dermatitis11,12. Er is veel informatie in de hoge frequentie regio van confocale Ramanspectroscopie (2500 – 4000 cm-1), waar water produceert verschillende pieken in de regio tussen 3250 – 3550 cm-1. Echter, de Raman pieken van eiwitten en lipiden, die zijn gecentreerd tussen ongeveer 2800 – 3000 cm-1, elkaar overlappen, omdat de signalen worden voornamelijk geproduceerd uit methyleen (-CH2-) en methyl (-CH3) groepen13 . Deze overlappende informatie geeft een technische uitdaging bij het verkrijgen van relatieve hoeveelheden van individuele moleculaire soorten. Piek fitting14,15 en selectieve piekpositie12,16 benaderingen zijn gebruikt om deze uitdaging op te lossen. Echter, het is moeilijk voor deze single Peak-gebaseerde methoden om zuivere component informatie te extraheren, omdat meerdere Raman pieken van dezelfde component tegelijkertijd veranderen17. In onze recente publicatie18werd een MCR-benadering voorgesteld om de zuivere component informatie te verheldering. Met behulp van deze benadering werden drie componenten (water, eiwitten en lipiden) geëxtraheerd uit een grote in vivo Confocale Raman spectroscopische gegevensset.
De uitvoering van grote klinische studies kan veeleisend zijn voor individuen die in vivo spectroscopische gegevens verzamelen. In sommige gevallen kan spectrale acquisitie gedurende vele uren op een dag besturingsapparatuur vereisen en kan de studie tot weken of maanden duren. Onder deze omstandigheden kunnen spectroscopische gegevens worden gegenereerd door exploitanten van apparatuur die niet over de technische deskundigheid beschikken om alle bronnen van spectroscopische artefacten te identificeren, uit te sluiten en te corrigeren. De resulterende gegevensset kan een kleine fractie van spectroscopische uitschieters bevatten die voorafgaand aan de analyse moeten worden geïdentificeerd en uitgesloten van de gegevens. Dit document illustreert in detail een chemometrische analyseproces voor het “opschonen” van een klinisch Raman gegevensset voordat de gegevens met MCR analyseren. Om de uitschieters met succes te verwijderen, moeten de typen uitschieters en de mogelijke oorzaak voor het genereren van de spectra in uitschieter worden geïdentificeerd. Vervolgens kan een specifieke aanpak worden ontwikkeld om de beoogde uitschieters te verwijderen. Dit vereist voorafgaande kennis van de gegevensset, inclusief een gedetailleerd inzicht in het proces voor het genereren van gegevens en het ontwerp van de studie. In deze gegevensset zijn de meeste uitschieters laag signaal-ruis Spectra en komen voornamelijk uit 1) spectra die boven het huidoppervlak worden verzameld (6.208 van 30.862), en 2) sterke bijdrage aan het spectrum van fluorescerende kamer verlichting (67 van 30.862). Spectra die boven het huidoppervlak worden verzameld, produceren een zwakke Raman-respons, omdat het Laser brandpunt het huidoppervlak benadert en zich meestal in het instrumenten venster onder de huid bevindt. Spectra met een sterke bijdrage van fluorescerende kamer licht worden gegenereerd als gevolg van een fout in de instrument operator of een beweging van het onderwerp, die een voorwaarde oplevert waarbij het Confocale Raman-collectie venster niet volledig wordt gedekt door de lichaams site van het onderwerp. Hoewel deze soorten spectrale artefacten kunnen worden geïdentificeerd en hersteld tijdens spectrale verwerving door een spectroscopische deskundige op het moment van gegevensverwerving, werden de in deze studie gebruikte getrainde instrumenten operatoren geïnstrueerd om alle gegevens te verzamelen, tenzij een onherstelbare fout is waargenomen. De taak van het identificeren en uitsluiten van uitschieters is opgenomen in het Data Analysis protocol. Het gepresenteerde protocol is ontwikkeld om deze uitdaging op te lossen. Om de lage signaal-ruis Spectra boven het huidoppervlak aan te pakken, moet de locatie van het huidoppervlak eerst worden bepaald om het verwijderen van spectra die boven het huidoppervlak zijn verzameld mogelijk te maken. De locatie van het huidoppervlak wordt gedefinieerd als de diepte waar het brandpunt van de Raman-laser de helft van de huid is en de helft uit de huid, zoals geïllustreerd in aanvullend figuur 1. Na het verwijderen van lage signaal-ruis spectra, wordt een principal component Analysis (PCA) geïmplementeerd om de factor te extraheren die gedomineerd wordt door fluorescerende kamer licht pieken. Deze uitschieters worden verwijderd op basis van de Score waarde van de corresponderende factor.
Dit protocol bevat gedetailleerde informatie over de manier waarop zes hoofdonderdelen worden bepaald in het MCR-proces. Dit gebeurt via een PCA-analyse gevolgd door spectrale vorm vergelijking tussen de ladingen voor modellen die worden gegenereerd met een verschillend aantal hoofdcomponenten. Het experimentele proces voor het verzamelen van gegevens van referentiematerialen en de menselijke proefpersonen wordt ook gedetailleerd toegelicht.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tijdens het verzamelen van gegevens, zoals beschreven in sectie 2 en 3 van het Protocol, werd elk diepte profiel verzameld in een gebied met contact tussen het instrument venster en de huid door het vinden van de donkere gebieden van de microscopische beelden gemarkeerd in de rode cirkels in Figuur 2C. Zodra deze gebieden waren gevestigd, was het van cruciaal belang om het diepte profiel boven het huidoppervlak te starten om de locatie van het huidoppervlak voor de data-ana…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen sterk de financiële steun van de afdeling analytische en persoonlijke reinigings zorg van het bedrijf. We willen onze dankbaarheid betuigen aan de analytische Associate Directors MS. Jasmine Wang en Dr. Robb Gardner voor hun begeleiding en ondersteuning en mevrouw Li Yang voor haar hulp bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
