Risolvere acqua, proteine e lipidi da In Vivo Confocal Raman Spectra di Stratum Corneum attraverso un approccio chemiometrico
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la raccolta di spettri Raman confocali da soggetti umani in studi clinici combinati con approcci chemiometrici per la rimozione degli outlier spettrali e la successiva estrazione di caratteristiche chiave.
Abstract
Lo sviluppo di questo metodo spettroscopico Raman confocale in vivo consente la misurazione diretta di acqua, proteine e lipidi con risoluzione di profondità nei soggetti umani. Queste informazioni sono molto importanti per le malattie legate alla pelle e caratterizzano le prestazioni dei prodotti per la cura della pelle. Questo protocollo illustra un metodo per la raccolta di spettri confocali Raman e la successiva analisi del set di dati spettrale sfruttando la chemiometria. L’obiettivo di questo metodo è quello di stabilire un protocollo standard per la raccolta dei dati e fornire indicazioni generali per l’analisi dei dati. La pre-elaborazione (ad esempio, la rimozione degli spettri anomali) è una fase critica nell’elaborazione di set di dati di grandi dimensioni da studi clinici. Ad esempio, forniamo indicazioni basate sulla conoscenza preliminare di un set di dati per identificare i tipi di outlier e sviluppare strategie specifiche per rimuoverli. Viene eseguita un’analisi dei componenti principali e gli spettri di carico vengono confrontati con gli spettri dei materiali di riferimento per selezionare il numero di componenti utilizzati nell’analisi finale della risoluzione della curva multivariata (MCR). Questo approccio ha esito positivo per l’estrazione di informazioni significative da un set di dati spettrale di grandi dimensioni.
Introduction
Negli studi clinici, la spettroscopia Raman confocale in vivo ha dimostrato la sua capacità unica di determinare lo spessore dello strato di corneo e il contenuto d’acqua1,2,3,4e di tracciare la penetrazione materiali attivi applicati topicamente alla pelle5,6. Come approccio non invasivo, la spettroscopia confocale Raman rileva i segnali molecolari in base alle modalità vibrazionali. Pertanto, l’etichettatura non è necessaria7. La spettroscopia Raman confocale in vivo fornisce informazioni chimiche con risoluzione di profondità basata sulla natura confocale della tecnica. Queste informazioni dipendenti dalla profondità sono molto utili per studiare gli effetti dei prodotti per la cura della pelle4,8, invecchiamento9,10, cambiamenti stagionali3, così come le malattie di funzione di barriera cutanea, come la dermatite atopica11,12. Ci sono molte informazioni nella regione ad alta frequenza della spettroscopia confocale Raman (2.500–4.000 cm-1), dove l’acqua produce picchi distinti nella regione tra 3.250–3.550 cm-1. Tuttavia, i picchi Raman di proteine e lipidi, che sono centrati tra circa 2.800-3.000 cm-1, si sovrappongono a vicenda perché i segnali sono prodotti principalmente da gruppi di metilene (-CH2-) e metili (-CH3)13 . Queste informazioni sovrapposte presentano una sfida tecnica quando si ottengono quantità relative di singole specie molecolari. Per risolvere questa sfida sono stati utilizzati il montaggio di picco14,15 e la posizione di picco selettiva12,16 approcci. Tuttavia, è difficile per questi singoli metodi basati sul picco estrarre le informazioni pure sui componenti perché più picchi Raman dallo stesso componente cambiano contemporaneamente17. Nella nostra recente pubblicazione18è stato proposto un approccio MCR per chiarire le informazioni pure sui componenti. Utilizzando questo approccio, tre componenti (acqua, proteine e lipidi) sono stati estratti da un grande set di dati spettroscopici Raman confocale in vivo.
L’esecuzione di grandi studi clinici può essere impegnativa per gli individui che raccolgono dati spettroscopici in vivo. In alcuni casi, l’acquisizione spettrale può richiedere attrezzature operative per molte ore in un giorno e lo studio può estendersi fino a settimane o mesi. In queste condizioni, i dati spettroscopici possono essere generati da operatori di apparecchiature che non dispongono delle competenze tecniche necessarie per identificare, escludere e correggere tutte le fonti di artefatti spettroscopici. Il set di dati risultante può contenere una piccola frazione di outlier spettroscopici che devono essere identificati ed esclusi dai dati prima dell’analisi. Questo documento illustra in dettaglio un processo di analisi chemiometrica per “ripulire” un set di dati Clinico Raman prima di analizzare i dati con MCR. Per rimuovere correttamente gli outlier, è necessario identificare i tipi di outlier e la causa potenziale per la generazione degli spettri outlier. Quindi, è possibile sviluppare un approccio specifico per rimuovere gli outlier mirati. Ciò richiede una conoscenza preliminare del set di dati, inclusa una comprensione dettagliata del processo di generazione dei dati e della progettazione dello studio. In questo set di dati, la maggior parte degli outlier sono spettri bassi segnale-rumore e provengono principalmente da 1) spettri raccolti sopra la superficie della pelle (6.208 su 30.862) e 2) forte contributo allo spettro dalla luce della stanza fluorescente (67 su 30.862). Gli spettri raccolti sopra la superficie della pelle producono una risposta Raman debole, poiché il punto focale laser si avvicina alla superficie della pelle ed è per lo più nella finestra dello strumento sotto la pelle. Gli spettri con un forte contributo dalla luce fluorescente della stanza vengono generati a causa dell’errore dell’operatore dello strumento o del movimento del soggetto, il che produce una condizione in cui la finestra di raccolta confocale Raman non è completamente coperta dal sito del corpo del soggetto. Sebbene questi tipi di artefatti spettrali possano essere identificati e corretti durante l’acquisizione spettrale da parte di un esperto spettroscopico al momento dell’acquisizione dei dati, gli operatori di strumenti addestrati utilizzati in questo studio sono stati istruiti a raccogliere tutti i dati, a meno che è stato osservato un guasto catastrofico. Il compito di identificare ed escludere gli outlier è incorporato nel protocollo di analisi dei dati. Il protocollo presentato è stato sviluppato per risolvere questa sfida. Per affrontare gli spettri basso segnale-rumore sopra la superficie della pelle, la posizione della superficie della pelle deve essere determinata prima per consentire la rimozione degli spettri raccolti sopra la superficie della pelle. La posizione della superficie della pelle è definita come la profondità in cui il punto focale laser Raman è la metà della pelle e la metà fuori della pelle, come illustrato nella figura supplementare 1. Dopo aver rimosso gli spettri bassi segnale-rumore, viene implementata un’analisi principale dei componenti (PCA) per estrarre il fattore dominato dai picchi di luce ambiente fluorescenti. Questi outlier vengono rimossi in base al valore del punteggio del fattore corrispondente.
Questo protocollo fornisce informazioni dettagliate su come vengono determinati sei componenti principali nel processo MCR. Questo viene fatto attraverso un’analisi PCA seguita da confronto forma spettrale tra i carichi per i modelli generati con un diverso numero di componenti principali. Il processo sperimentale per la raccolta dei dati dei materiali di riferimento e dei soggetti umani è anche spiegato in dettaglio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la raccolta dei dati, come descritto nei paragrafi 2 e 3 del protocollo, ogni profilo di profondità è stato raccolto in un’area con contatto tra la finestra dello strumento e la pelle trovando le aree più scure dalle immagini microscopiche evidenziate nei cerchi rossi in Figura 2C. Una volta individuate queste aree, è stato fondamentale iniziare il profilo di profondità sopra la superficie della pelle per determinare con precisione la posizione della superficie…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono molto il sostegno finanziario del dipartimento di assistenza alla pulizia della pulizia aziendale. Vogliamo esprimere la nostra gratitudine ai direttori associati analitici Ms. Jasmine Wang e Dr. Robb Gardner per la loro guida e supporto e la signora Li Yang per il suo aiuto sulla raccolta dei dati.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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