Resolución de agua, proteínas y lípidos de In Vivo Confocal Raman Spectra de Stratum Corneum a través de un enfoque quimiométrico
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para la recolección de espectros Raman confocales de sujetos humanos en estudios clínicos combinados con enfoques quimiométricos para la eliminación de valores atípicos espectrales y la posterior extracción de características clave.
Abstract
El desarrollo de este método espectroscópico Deraman confocal in vivo permite la medición directa de agua, proteínas y lípidos con resolución de profundidad en sujetos humanos. Esta información es muy importante para las enfermedades relacionadas con la piel y caracterizar el rendimiento del producto para el cuidado de la piel. Este protocolo ilustra un método para la recolección de espectros Raman confocales y el análisis posterior del conjunto de datos espectral aprovechando la quimiometría. El objetivo de este método es establecer un protocolo estándar para la recopilación de datos y proporcionar orientación general para el análisis de datos. El preprocesamiento (por ejemplo, la eliminación de espectros atípicos) es un paso crítico al procesar grandes conjuntos de datos de estudios clínicos. Como ejemplo, proporcionamos orientación basada en el conocimiento previo de un conjunto de datos para identificar los tipos de valores atípicos y desarrollar estrategias específicas para eliminarlos. Se realiza un análisis de componentes principales y los espectros de carga se comparan con los espectros de los materiales de referencia para seleccionar el número de componentes utilizados en el análisis final de la resolución de curva sorcada (MCR). Este enfoque es exitoso para extraer información significativa de un dataset espectral grande.
Introduction
En estudios clínicos, la espectroscopia in vivo confocal de Raman ha demostrado su capacidad única para determinar el espesor del estrato córneo y el contenido de agua1,2,3,4, y el seguimiento de la penetración de materiales activos aplicados tópicamente a la piel5,6. Como enfoque no invasivo, la espectroscopia confocal de Raman detecta señales moleculares basadas en modos vibratorios. Por lo tanto, el etiquetado no es necesario7. La espectroscopia In vivo confocal de Raman proporciona información química con resolución de profundidad basada en la naturaleza confocal de la técnica. Esta información dependiente de la profundidad es muy útil en el estudio de los efectos de los productos para el cuidado de la piel4,8, envejecimiento9,10, cambios estacionales3, así como enfermedades de la función de barrera de la piel, como la dermatitis atópica11,12. Hay mucha información en la región de alta frecuencia de espectroscopia raman confocal (2.500-4.000 cm-1), donde el agua produce picos distintos en la región entre 3.250-3.550 cm-1. Sin embargo, los picos Raman de proteínas y lípidos, que se centran entre aproximadamente 2.800-3.000 cm-1, se superponen entre sí porque las señales se producen principalmente a partir de metileno (-CH2-) y metil (-CH3) grupos13 . Esta información superpuesta presenta un desafío técnico al obtener cantidades relativas de especies moleculares individuales. Se han utilizado los enfoques de ajuste máximo14,15 y posición pico selectiva12,16 para resolver este desafío. Sin embargo, es difícil para estos métodos basados en picos únicos extraer información de componentes puros porque varios picos Raman del mismo componente cambian simultáneamente17. En nuestra reciente publicación18, se propuso un enfoque MCR para dilucidar la información de componentes puros. Con este enfoque, se extrajeron tres componentes (agua, proteínas y lípidos) de un conjunto de datos espectroscópico Raman confocal grande in vivo.
La ejecución de grandes estudios clínicos puede ser exigente en individuos que recopilan datos espectroscópicos in vivo. En algunos casos, la adquisición espectral puede requerir equipo operativo durante muchas horas al día y el estudio puede extenderse hasta semanas o meses. En estas condiciones, los operadores de equipos que carecen de la experiencia técnica para identificar, excluir y corregir para todas las fuentes de artefactos espectroscópicos pueden generar datos espectroscópicos. El conjunto de datos resultante puede contener una pequeña fracción de valores atípicos espectroscópicos que deben identificarse y excluirse de los datos antes del análisis. Este documento ilustra en detalle un proceso de análisis quimiométrico para “limpiar” un conjunto de datos clínico de Raman antes de analizar los datos con MCR. Para eliminar con éxito los valores atípicos, es necesario identificar los tipos de valores atípicos y la posible causa de la generación de los espectros atípicos. A continuación, se puede desarrollar un enfoque específico para eliminar los valores atípicos de destino. Esto requiere un conocimiento previo del conjunto de datos, incluida una comprensión detallada sobre el proceso de generación de datos y el diseño del estudio. En este conjunto de datos, la mayoría de los valores atípicos son espectros de señal a ruido bajos y se originan principalmente a partir de 1) espectros recogidos por encima de la superficie de la piel (6.208 de 30.862), y 2) una fuerte contribución al espectro de la luz fluorescente de la habitación (67 de 30.862). Los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel producen una respuesta Raman débil, ya que el punto focal del láser se acerca a la superficie de la piel y se encuentra principalmente en la ventana del instrumento debajo de la piel. Los espectros con una fuerte contribución de la luz fluorescente de la sala se generan debido a un error del operador del instrumento o al movimiento del sujeto, lo que produce una condición en la que la ventana de colección confocal de Raman no está completamente cubierta por el sitio del cuerpo del sujeto. Aunque estos tipos de artefactos espectrales podían ser identificados y remediados durante la adquisición espectral por un experto espectroscópico en el momento de la adquisición de datos, los operadores de instrumentos capacitados utilizados en este estudio recibieron instrucciones para recopilar todos los datos a menos que se observó un fallo catastrófico. La tarea de identificar y excluir valores atípicos se incorpora al protocolo de análisis de datos. El protocolo presentado está desarrollado para resolver este desafío. Para abordar los espectros de señal a ruido bajos por encima de la superficie de la piel, la ubicación de la superficie de la piel debe determinarse primero para permitir la eliminación de los espectros recogidos por encima de la superficie de la piel. La ubicación de la superficie de la piel se define como la profundidad donde el punto focal láser Raman está la mitad en la piel y la mitad fuera de la piel como se ilustra en la Figura Suplementaria 1. Después de eliminar espectros bajos de señal a ruido, se implementa un análisis de componentes principales (PCA) para extraer el factor dominado por picos de luz fluorescente de la sala. Estos valores atípicos se eliminan en función del valor de puntuación del factor correspondiente.
Este protocolo proporciona información detallada sobre cómo se determinan seis componentes principales en el proceso MCR. Esto se hace a través de un análisis de PCA seguido de la comparación de la forma espectral entre las cargas de los modelos generados con un número diferente de componentes principales. También se explica en detalle el proceso experimental para la recopilación de datos de materiales de referencia, así como de los sujetos humanos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Durante la recopilación de datos, como se describe en las secciones 2 y 3 del protocolo, cada perfil de profundidad se recopiló en un área con contacto entre la ventana del instrumento y la piel mediante la búsqueda de las áreas más oscuras de las imágenes microscópicas resaltadas en los círculos rojos en Figura 2C. Una vez localizadas estas áreas, fue fundamental iniciar el perfil de profundidad por encima de la superficie de la piel para determinar con precisió…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen en gran medida el apoyo financiero del departamento de atención analítica y de limpieza personal de la función corporativa. Queremos expresar nuestra gratitud a los directores asociados analíticos, Sra. Jasmine Wang y Dr. Robb Gardner, por su orientación y apoyo y a la Sra. Li Yang por su ayuda en la recopilación de datos.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
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