Lösning av vatten, proteiner och lipider från in vivo konfokala Raman-spektra av stratum corneum genom en Chemometrisk metod
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för insamling av konfokala Raman-spektra från försökspersoner i kliniska studier kombinerat med chemometriska metoder för avlägsnande av spektral avvikare och efterföljande extraktion av viktiga funktioner.
Abstract
Utveckling av detta in vivo konfokala Raman spektroskopiska metod möjliggör direkt mätning av vatten, proteiner och lipider med djup upplösning hos försökspersoner. Denna information är mycket viktigt för hudrelaterade sjukdomar och karakterisera hudvård produktprestanda. Detta protokoll illustrerar en metod för konfokalmikroskopi Raman spectra Collection och den efterföljande analysen av spektraldata uppsättningen som utnyttjar kemometri. Målet med den här metoden är att etablera ett standardprotokoll för datainsamling och ge allmän vägledning för dataanalys. Förbehandling (t. ex. avlägsnande av avvikare Spectra) är ett kritiskt steg vid bearbetning av stora datamängder från kliniska studier. Som ett exempel ger vi vägledning baserat på tidigare kunskaper om en datauppsättning för att identifiera typer av extremvärden och utveckla specifika strategier för att ta bort dem. En huvudkomponent analys utförs och belastnings spektra jämförs med spektra från referensmaterial för att välja det antal komponenter som används i den slutliga MCR-analysen (multivariat Curve resolution). Den här metoden är lyckad för att extrahera meningsfull information från en stor spektraldata uppsättning.
Introduction
I kliniska studier, in vivo konfokal Raman spektroskopi har visat sin unika förmåga att bestämma stratum hornlagret tjocklek och vattenhalt1,2,3,4, och spåra inträngning av aktiva material appliceras topikalt på huden5,6. Som icke-invasiv metod detekterar konfokal Raman-spektroskopi molekylära signaler baserade på vibrationella lägen. Sålunda, märkning behövs inte7. In vivo konfokal Raman spektroskopi ger kemisk information med djup upplösning baserad på den konfokala karaktären av tekniken. Denna djup-beroendeinformation är mycket användbar för att studera effekterna av hudvårdsprodukter4,8, åldrande9,10, säsongsbetingade förändringar3, samt hudbarriär funktion sjukdomar, såsom atopisk dermatit11,12. Det finns en hel del information i hög frekvens regionen av konfokala Raman spektroskopi (2500-4000 cm-1), där vatten producerar distinkta toppar i regionen mellan 3250-3550 cm-1. Men de Raman toppar av proteiner och lipider, som är centrerad mellan cirka 2800-3000 cm-1, överlappar varandra eftersom signalerna huvudsakligen produceras från metylenblått (-CH2-) och metyl (-CH3) grupper13 . Denna överlappande information utgör en teknisk utmaning när man erhåller relativa mängder av enskilda molekylära arter. Peak fitting14,15 och selektiv topp position12,16 metoder har använts för att lösa denna utmaning. Det är dock svårt för dessa Single Peak-baserade metoder för att extrahera ren komponentinformation eftersom flera Raman toppar från samma komponent ändras samtidigt17. I vår senaste publikation18föreslogs en MCR-strategi för att belysa den rena komponentinformationen. Med denna metod har tre komponenter (vatten, proteiner och lipider) extraherats från en stor in vivo konfokal Raman spektroskopisk DataSet.
Utförandet av stora kliniska studier kan vara krävande för individer som samlar in vivo spektroskopiska data. I vissa fall, spektralförvärv kan kräva operativ utrustning för många timmar på en dag och studien kan sträcka sig upp till veckor eller månader. Under dessa förhållanden kan spektroskopiska data genereras av utrustnings operatörer som saknar teknisk expertis för att identifiera, utesluta och korrigera för alla källor till spektroskopiska artefakter. Den resulterande datamängden kan innehålla en liten del av spektroskopiska extremvärden som måste identifieras och uteslutas från data före analys. Denna uppsats illustrerar i detalj en kemometriska analys process för att “städa upp” en klinisk Raman dataset innan du analyserar data med MCR. För att framgångsrikt ta bort avvikare, typer av extremvärden och den potentiella orsaken till generering av avvikare Spectra måste identifieras. Sedan kan ett specifikt tillvägagångssätt utvecklas för att ta bort riktade avvikare. Detta kräver förkunskaper i datauppsättningen, inklusive en detaljerad förståelse för data generations processen och studiens utformning. I den här datauppsättningen är de flesta avvikare låga signal-till-brus-spektra och kommer primärt från 1) spektra som samlats in ovanför hudytan (6 208 av 30 862) och 2) starkt bidrag till spektrumet från fluorescerande rums ljus (67 av 30 862). Spektra som samlats över hudytan ger ett svagt Raman-svar, eftersom laser brännpunkten närmar sig hudytan och är mestadels i instrument fönstret under huden. Spektra med ett starkt bidrag från Lysrörs rum ljus genereras på grund av antingen instrument operatör fel eller ämne rörelse, som producerar ett tillstånd där den konfokala Raman Collection fönstret inte är helt täckt av försöks platsens kropps plats. Även om dessa typer av spektralartefakter kunde identifieras och åtgärdas under spektralförvärvet av en spektroskopisk expert vid tidpunkten för datainhämtningen, instruerades de utbildade instrument operatörerna som användes i denna studie att samla in alla data om inte en oåterkalleligt misslyckande observerades. Uppgiften att identifiera och utesluta extremvärden införlivas i dataanalys protokollet. Det protokoll som presenteras är utvecklat för att lösa denna utmaning. För att ta itu med de låga signal-till-brus-spektra ovanför hudytan måste placeringen av hudytan bestämmas först för att tillåta avlägsnande av spektra som samlats upp ovanför hudytan. Placeringen av hudytan definieras som det djup där Raman laser brännpunkt är hälften i huden och hälften ut ur huden som illustreras i kompletterande figur 1. Efter att ha avlägsnat låg signal-till-brus Spectra, en huvudsaklig komponent analys (PCA) genomförs för att extrahera faktorn domineras av fluorescerande rum ljus toppar. Dessa avvikare tas bort baserat på poängvärdet för motsvarande faktor.
Det här protokollet innehåller detaljerad information om hur sex huvudkomponenter bestäms i MCR-processen. Detta görs genom en PCA-analys följt av spektralform jämförelse mellan belastningar för modeller som genereras med olika antal huvudkomponenter. Även försöks processen för datainsamling av referensmaterial och de mänskliga ämnena förklaras i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under datainsamlingen, som beskrivs i avsnitt 2 och 3 i protokollet, samlades varje djup profil i ett område med kontakt mellan instrument fönstret och huden genom att hitta de mörkare områdena från de mikroskopiska bilderna som belystes i de röda cirklarna i Figur 2C. När dessa områden var placerade var det viktigt att starta djup profilen ovanför hudytan för att exakt bestämma placeringen av hudytan för dataanalys proceduren. Placeringen av hudytan användes d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna erkänner starkt det ekonomiska stödet från Corporate funktion analytisk och personlig rensning vårdavdelning. Vi vill uttrycka vår tacksamhet till analytiska biträdande direktörer MS Jasmine Wang och Dr Robb Gardner för deras vägledning och stöd och MS Li Yang för hennes hjälp med datainsamling.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
