Stratum Corneum'un In Vivo Confokal Raman Spektrumlarından Kemometrik Yaklaşımla Su, Protein ve Lipidlerin Çözülmesi
Summary
Burada, spektral dış atriden çıkarılması ve daha sonra temel özelliklerin çıkarılması için kemometrik yaklaşımlar ile birlikte klinik çalışmalarda insan deneklerinden konfokal Raman spektrasının toplanması için bir protokol saklıyız.
Abstract
Bu in vivo konfokal Raman spektroskopik yöntemin geliştirilmesi insan deneklerde derinlik çözünürlüğü ile su, protein ve lipidlerin doğrudan ölçülmesini sağlar. Bu bilgiler ciltle ilgili hastalıklar ve cilt bakım ürün performansı nın karakterizei için çok önemlidir. Bu protokol, konfokal Raman spektrum toplama yöntemini ve kemometriden yararlanan spektral veri setinin sonraki analizini göstermektedir. Bu yöntemin amacı, veri toplama için standart bir protokol oluşturmak ve veri analizi için genel rehberlik sağlamaktır. Ön işleme (örneğin, aykırı spektrumların kaldırılması) klinik çalışmalardan büyük veri kümelerini işlerken kritik bir adımdır. Örnek olarak, aykırı kişilerin türlerini belirlemek ve bunları kaldırmak için belirli stratejiler geliştirmek için bir veri kümesinin önceden bilgisine dayalı rehberlik sağlarız. Bir temel bileşen analizi gerçekleştirilir ve yükleme spektrumları son çok değişkenli eğri çözünürlük (MCR) analizinde kullanılan bileşen sayısını seçmek için referans malzemelerden spektrumlarla karşılaştırılır. Bu yaklaşım, büyük bir spektral veri kümesinden anlamlı bilgi ayıklamak için başarılı dır.
Introduction
Klinik çalışmalarda, in vivo konfokal Raman spektroskopistrat korneum kalınlığı ve su içeriği1,2,3,4belirlemek için eşsiz yeteneğini göstermiştir ve penetrasyon izleme aktif maddeler topikal cilde uygulanan5,6. Noninvaziv bir yaklaşım olarak, konfokal Raman spektroskopisi titreşim modlarına göre moleküler sinyalleri algılar. Bu nedenle, etiketleme7gerekli değildir. In vivo confokal Raman spektroskopisi tekniğin konfokal doğasına göre derinlik çözünürlüğü ile kimyasal bilgi sağlar. Bu derinliğe bağlı bilgi cilt bakım ürünleri4,8,yaşlanma9,10, mevsimsel değişiklikler3,yanı sıra cilt bariyerfonksiyon hastalıklarının etkilerini çalışmada çok yararlıdır, atopik dermatit gibi11,12. Konfokal Raman spektroskopisinin yüksek frekanslı bölgesinde (2.500-4.000 cm-1)çok fazla bilgi vardır ve burada su 3.250-3.550 cm-1arasında bölgede belirgin zirveler üretir. Ancak, yaklaşık 2.800-3.000 cm-1arasında ortalanan protein ve lipidlerin Raman zirveleri, sinyaller esas olarak metilen (-CH2-) ve metil (-CH3)gruplarından üretildiği için birbiriyle örtüşmektedir13 . Bu örtüşen bilgiler, tek tek moleküler türlerin göreceli miktarda elde ederken teknik bir sorun teşkil etmektedir. Tepe uydurma14,15 ve seçici tepe konumu12,16 yaklaşımlar bu sorunu çözmek için kullanılmıştır. Ancak, aynı bileşenden birden çok Raman tepe noktası aynı anda17olarak değiştiğinden, bu tek tepe tabanlı yöntemlerin saf bileşen bilgilerini ayıklamaları zordur. Bizim son yayın18,bir MCR yaklaşım saf bileşen bilgilerini açıklamak için önerilmiştir. Bu yaklaşım kullanılarak, büyük bir in vivo konfokal Raman spektroskopik veri setinden üç bileşen (su, protein ve lipidler) çıkarıldı.
Büyük klinik çalışmaların yürütülmesi in vivo spektroskopik veri toplayan bireyler üzerinde talep olabilir. Bazı durumlarda, spektral edinimi bir gün içinde birçok saat için işletim ekipmanı gerektirebilir ve çalışma haftalar veya aylara kadar uzayabilir. Bu koşullar altında, spektroskopik veriler, tüm spektroskopik eserler kaynaklarını tanımlamak, dışlamak ve düzeltmek için teknik uzmanlığa sahip olmayan ekipman operatörleri tarafından oluşturulabilir. Elde edilen veri kümesi, analizden önce tanımlanması ve verilerden dışlanması gereken spektroskopik aykırılıkların küçük bir kısmını içerebilir. Bu makalede, MCR ile verileri analiz etmeden önce klinik Raman veri kümesini “temizlemek” için bir kemometrik analiz süreci ayrıntılı olarak gösteriş. Aykırılaştırıcıları başarılı bir şekilde kaldırmak için, aykırı lık türleri ve aykırı spektrumların üretimi için potansiyel nedenin tanımlanması gerekir. Daha sonra, hedeflenen aykırı kaldırmak için belirli bir yaklaşım geliştirilebilir. Bu, veri oluşturma süreci ve çalışma tasarımı hakkında ayrıntılı bir anlayış da dahil olmak üzere veri kümesi hakkında önceden bilgi gerektirir. Bu veri setinde, aykırı ların çoğu düşük sinyal-gürültü spektrumlarıdır ve öncelikle cilt yüzeyinin üzerinde toplanan spektrumlardan (30.862’nin 6.208’i) ve 2) floresan oda Lambasından spektruma güçlü katkı (30.862’nin 67’si) kaynaklanmaktadır. Lazer odak noktası cilt yüzeyine yaklaştıkça ve çoğunlukla derinin altındaki alet penceresinde olduğundan, deri yüzeyinde toplanan spektrumlar zayıf bir Raman yanıtı üretir. Floresan oda ışığının güçlü bir katkısı olan spektrumlar, konfokal Raman toplama penceresinin deneğin vücut bölgesi tarafından tam olarak kapsanmayan bir durum yaratan enstrüman operatörü hatası veya denek hareketi nedeniyle oluşturulur. Bu tür spektral eserler, veri toplama sırasında spektroskopik bir uzman tarafından tespit edilip düzeltilebilse de, bu çalışmada kullanılan eğitimli cihaz operatörlerine, felaket başarısızlık gözlendi. Aykırıları tanımlama ve hariç çıkarma görevi veri çözümleme protokolüne dahil edilir. Sunulan protokol bu sorunu çözmek için geliştirilmiştir. Cilt yüzeyinin üzerindeki düşük sinyal-gürültü spektrumlarını gidermek için, cilt yüzeyinin üzerinde toplanan spektrumların uzaklaştırılmasına izin vermek için öncelikle cilt yüzeyinin yerinin belirlenmesi gerekir. Cilt yüzeyinin konumu Raman lazer odak noktasının ciltte yarısı, cilttenyarısının ise Ek Şekil 1’de gösterildiği gibi olduğu derinlik olarak tanımlanır. Düşük sinyal-gürültü spektrumları çıkarıldıktan sonra, floresan oda ışık zirveleri hakim faktör ayıklamak için bir temel bileşen analizi (PCA) uygulanır. Bu aykırılar, ilgili faktörün puan değerine göre kaldırılır.
Bu protokol, MCR işleminde altı temel bileşenin nasıl belirlendiği hakkında ayrıntılı bilgi sağlar. Bu, farklı sayıda ana bileşenle oluşturulan modeller için yüklemeler arasında spektral şekil karşılaştırması takip eden bir PCA analizi ile yapılır. Referans materyallerin ve insan deneklerin veri toplaması için deneysel süreç de ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Veri toplama sırasında, protokolün bölüm 2 ve 3’te açıklandığı gibi, her derinlik profili, gösterge penceresi ile deri arasında temas olan bir alanda, kırmızı dairelerde vurgulanan mikroskobik görüntülerden daha koyu alanları bularak toplanmıştır. Şekil 2C. Bu alanlar tespit edildikten sonra, veri analizi prosedürü için deri yüzeyinin konumunu doğru bir şekilde belirlemek için cilt yüzeyinin üzerindeki derinlik profilinin başlatılması çok …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar büyük ölçüde kurumsal fonksiyon analitik ve kişisel temizlik bakım departmanı mali destek kabul. Analitik yardımcı yönetmenler Bayan Jasmine Wang ve Dr. Robb Gardner’a rehberlik ve desteklerinden dolayı şükranlarımızı sunmak ve veri toplama konusundaki yardımları için Bayan Li Yang’a teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | ||
| Cholesterol 3-sulfate sodium | Sigma-Aldrich | ||
| D-Erythro-Dihydrosphingosine | Sigma-Aldrich | ||
| DI water | Purified with Milipore(18.2MΩ) | ||
| Gen2-SCA skin analyzer | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | Gen2 | |
| Matlab 2018b | Mathwork | 2018b | |
| N-behenoyl-D-erythro-sphingosine | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| N-Lignoceroyl-D-erythro-sphinganine(ceramide) | Avanti Polar Lipids, Inc. | ||
| Oleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| Palmitoleic Acid | Sigma-Aldrich | ||
| PLS_Toolbox version 8.2 | Eigenvector Research Inc. | 8.2 | |
| RiverICon | River Diagnostics, Rotterdam, The Netherlands | version 3.2 | |
| Squalene | Sigma-Aldrich | ||
| Stearic Acid | Sigma-Aldrich |
References
- Caspers, P., Lucassen, G., Bruining, H., Puppels, G. Automated depth – scanning confocal Raman microspectrometer for rapid in vivo determination of water concentration profiles in human skin. Journal of Raman Spectroscopy. 31 (8-9), 813-818 (2000).
- Crowther, J., et al. Measuring the effects of topical moisturizers on changes in stratum corneum thickness, water gradients and hydration in vivo. British Journal of Dermatology. 159 (3), 567-577 (2008).
- Egawa, M., Tagami, H. Comparison of the depth profiles of water and water-binding substances in the stratum corneum determined in vivo by Raman spectroscopy between the cheek and volar forearm skin: effects of age, seasonal changes and artificial forced hydration. British Journal of Dermatology. 158 (2), 251-260 (2008).
- Crowther, J. M., Matts, P. J., Kaczvinsky, J. R. . Changes in Stratum Corneum Thickness, Water Gradients and Hydration by Moisturizers. , (2012).
- Pudney, P. D., Mélot, M., Caspers, P. J., Van, D. P. A., Puppels, G. J. An in vivo confocal Raman study of the delivery of trans retinol to the skin. Applied Spectroscopy. 61 (8), 804 (2007).
- Mohammed, D., Matts, P., Hadgraft, J., Lane, M. In vitro-in vivo correlation in skin permeation. Pharmaceutical Research. 31 (2), 394-400 (2014).
- Hanlon, E., et al. Prospects for in vivo Raman spectroscopy. Physics in Medicine and Biology. 45 (2), 1 (2000).
- Mohammed, D., Crowther, J. M., Matts, P. J., Hadgraft, J., Lane, M. E. Influence of niacinamide containing formulations on the molecular and biophysical properties of the stratum corneum. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 192-201 (2013).
- Boireau-Adamezyk, E., Baillet-Guffroy, A., Stamatas, G. Age-dependent changes in stratum corneum barrier function. Skin Research and Technology. 20 (4), 409-415 (2014).
- Pezzotti, G., et al. Raman spectroscopy of human skin: looking for a quantitative algorithm to reliably estimate human age. Journal of Biomedical Optics. 20 (6), 065008 (2015).
- Mlitz, V., et al. Impact of filaggrin mutations on Raman spectra and biophysical properties of the stratum corneum in mild to moderate atopic dermatitis. Journal of the European Academy of Dermatology and Venereology. 26 (8), 983-990 (2012).
- Janssens, M., et al. Lipid to protein ratio plays an important role in the skin barrier function in patients with atopic eczema. British Journal of Dermatology. 170 (6), 1248-1255 (2014).
- Faiman, R., Larsson, K. Assignment of the C H stretching vibrational frequencies in the Raman spectra of lipids. Journal of Raman Spectroscopy. 4 (4), 387-394 (1976).
- Edwards, H. G., Farwell, D. W., Williams, A. C., Barry, B. W., Rull, F. Novel spectroscopic deconvolution procedure for complex biological systems: vibrational components in the FT-Raman spectra of ice-man and contemporary skin. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions. 91 (21), 3883-3887 (1995).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Lipid organization and stratum corneum thickness determined in vivo in human skin analyzing lipid-keratin peak (2820-3030 cm- 1) using confocal Raman microscopy. Journal of Raman Spectroscopy. 47 (11), 1327-1331 (2016).
- Stamatas, G. N., de Sterke, J., Hauser, M., von Stetten, O., van der Pol, A. Lipid uptake and skin occlusion following topical application of oils on adult and infant skin. Journal of Dermatological Science. 50 (2), 135-142 (2008).
- Choe, C., Lademann, J., Darvin, M. E. Confocal Raman microscopy for investigating the penetration of various oils into the human skin in vivo. Journal of Dermatological Science. , (2015).
- Zhang, L., et al. A MCR approach revealing protein, water and lipid depth profile in atopic dermatitis patients’ stratum corneum via in vivo confocal Raman spectroscopy. Analytical Chemistry. , (2019).
- Caspers, P. J. . In vivo Skin Characterization by Confocal Raman Microspectroscopy. , (2003).
- Jaumot, J., de Juan, A., Tauler, R. MCR-ALS GUI 2.0: New features and applications. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 140, 1-12 (2015).
- Choe, C., Choe, S., Schleusener, J., Lademann, J., Darvin, M. E. Modified normalization method in in vivo stratum corneum analysis using confocal Raman microscopy to compensate nonhomogeneous distribution of keratin. Journal of Raman Spectroscopy. , (2019).
- Wise, B. M., et al. Chemometrics tutorial for PLS_Toolbox and Solo. Eigenvector Research, Inc. 3905, 102-159 (2006).
