Screening und Identifizierung von kleinen Peptiden Targeting Fibroblast Growth Factor Receptor2 mit einem Phage Display Peptid Bibliothek
Summary
Hierin präsentieren wir ein detailliertes Protokoll zum Screening kleiner Peptide, die mit einer Phagenanzeige-Peptidbibliothek an FGFR2 binden. Wir analysieren weiter die Affinität der ausgewählten Peptide zu FGFR2 in vitro und seine Fähigkeit, die Zellproliferation zu unterdrücken.
Abstract
Die menschliche Fibroblast Growth Factor Receptor (FGFR) Familie besteht aus vier Mitgliedern, nämlich FGFR1, FGFR2, FGFR3 und FGFR4, die an verschiedenen biologischen Aktivitäten wie Zellproliferation, Überleben, Migration und Differenzierung beteiligt sind. Mehrere Aberrationen im FGFR-Signalweg aufgrund von Mutationen oder Genamplifikationsereignissen wurden bei verschiedenen Krebsarten identifiziert. Daher konzentrierte sich die jüngste Forschung auf die Entwicklung von Strategien mit therapeutischer Ausrichtung von FGFRs. Aktuelle FGFR-Inhibitoren in verschiedenen Stadien der präklinischen und klinischen Entwicklung umfassen entweder kleine Molekülinhibitoren von Tyrosin-Kinasen oder monoklonale Antikörper, bei dem nur wenige Peptid-basierte Inhibitoren in der Pipeline sind. Hier stellen wir ein Protokoll mit Phagenanzeige-Technologie zur Verfügung, um kleine Peptide als Antagonisten von FGFR2 zu überprüfen. Kurz gesagt, wurde eine Bibliothek von Phagen-angezeigten Peptiden in einer Platte mit FGFR2 beschichtet inkubiert. Anschließend wurde ungebundener Phagen durch TBST abgewaschen (TBS + 0,1% [v/v] Tween-20), und gebundener Phagen wurde mit 0,2 M Glycin-HCl-Puffer (pH 2.2) eluiert. Der eluierte Phagen wurde weiter verstärkt und als Input für die nächste Runde der Biopannierung verwendet. Nach drei Runden Biopanning wurden die Peptidsequenzen einzelner Phagenklone durch DNA-Sequenzierung identifiziert. Schließlich wurden die gescreenten Peptide synthetisiert und auf Affinität und biologische Aktivität analysiert.
Introduction
Fibroblasten-Wachstumsfaktorrezeptoren (GFR) spielen eine Schlüsselrolle bei der Zellproliferation, Wundheilung und Angiogenese in vivo1. Aberrante Aktivierung der FGFR-Signalisierung, die bei einer Vielzahl von Tumoren beobachtet wurde2,3,4,5 umfasst Genverstärkung, Genmutationen, Chromosomenaberrationen und übermäßige Ligandensekretion6 . Viele Inhibitoren, die auf FGFRs abzielen, haben in klinischen Studien vielversprechende therapeutische Wirkungen gezeigt und werden hauptsächlich in drei Typen eingeteilt: (1) kleine Molekülkinase-Inhibitoren, die an die intrazelluläre Domäne von FGFR binden, (2) Antagonisten, die auf die extrazelluläres Segment und (3) FGF-Ligandenfallen6. Obwohl einige der kleinen Molekülkinase-Inhibitoren sowohl in vitro als auch in vivo7eine gute therapeutische Wirkung haben, haben die meisten von ihnen eine schlechte Zielspezifität und zeigen nebenwirkungende Wirkungen wie Bluthochdruck8. Die Mehrheit der Antagonisten sind monoklonale Antikörper9,10 und Polypeptide11. Peptide haben Vorteile gegenüber kleinen Molekülen aufgrund ihrer Spezifität und niedrigeren Nebenwirkungen. Sie behalten auch Zelldurchlässigkeit und akkumulieren nicht in bestimmten Organen im Vergleich zu Protein-Medikamente12. Daher sind gezielte kleine Peptide sowohl wirksame als auch prospektive therapeutische Wirkstoffe.
Phage Display-Technologie ist ein einfaches, aber leistungsfähiges Werkzeug zur Identifizierung von kleinen Peptiden, die an ein bestimmtes Molekül binden können13,14,15. Wir verwendeten eine Phagenanzeige Peptid-Bibliothek, die auf einem einfachen M13-Phagen mit über 109 verschiedenen Peptidsequenzen am Schwanz für die Bindung an das Zielmolekül basiert (siehe Tabelle der Materialien)16. Durch die hohe Affinität von Phagen zum gegebenen Molekül können ungebundene Phagen weggewaschen werden und nur eng gebundene Phagen mit den gewünschten kurzen Peptiden erhalten bleiben. Die gegebenen molekularen Ziele können immobilisierte Proteine17,18, Kohlenhydrate, kultivierte Zellen oder sogar anorganische Materialien19,20sein. Ein spannender Fall wurde berichtet, bei dem organspezifische Peptide in vivo mit der Phagenanzeigetechnologie21ausgewählt wurden. Zu den Vorteilen der Phagenanzeige-Technologie gehören hoher Durchsatz, einfache Bedienung, niedrige Kosten und eine breite Palette von Anwendungen22.
In dieser Studie bieten wir ein detailliertes Protokoll zum Screening kleiner Peptide, die mit hilfe einer Phagenanzeigebibliothek an das immobilisierte Protein (FGFR2) binden. Die Wirksamkeit der Technologie wird auch untersucht, indem die Affinität des erhaltenen Peptids zu FGFR2 durch Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) und die biologische Aktivität durch einen Zellproliferationstest gemessen wird. Die Methode kann für das Screening von kleinen Peptiden erweitert werden, die an Kohlenhydrate, kultivierte Zellen oder sogar anorganische Materialien binden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eine kombinatorische Phagenbibliothek ist ein leistungsfähiges und effektives Werkzeug für das Hochdurchsatzscreening neuartiger Peptide, die Zielmoleküle binden und ihre Funktion regulieren können13. Derzeit haben Phagenanzeige Peptidbibliotheken eine breite Palette von Anwendungen. Zum Beispiel können sie für die Auswahl von bioaktiven Peptiden verwendet werden, die an Rezeptorproteine23gebunden sind, Nicht-Protein-Targets24,<sup c…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Science and Technology Program of Guangzhou (Nr. 2016201604030039) unterstützt.
Materials
| 0.22 μm Filter | Merck Millipore | MPGP002A1 | |
| 35 cm2 Small dish | Thermo | 150460 | |
| 70% Ethanol | Guangzhou chemical reagent factory | 64-17-5 | |
| -96 gIII sequencing primer | Synthesis from Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| 96-well plate | Nest | 701001-2 | |
| Agar | Beyotime | ST004D | |
| Bacto-Tryptone | Oxoid | L0037 | |
| BALB/c 3T3 cells | ATCC | CRL-6587 | |
| BSA | Biodragon | BD-M10110 | |
| CCK-8 kit | DOJINDO | CK04 | |
| DMEM | Hyclone | sh30243.01 | |
| DMF | Newprobe | PB10247 | |
| EDTA | Invitrogen | 15576028 | |
| FGF2 Protein | Sino Biological Inc. | 10014-HNAE | Purity >95% |
| Glycine | Sigma | G8898-1KG | |
| IPTG | Beyotime | ST097 | |
| ITC200 system | MicroCal Omega | ||
| NaCl | Sigma | S6191 | |
| NaHCO3 | Guangzhou chemical reagent factory | 144-55-8 | |
| NaI | Bidepharm | BD40879 | |
| NaOH | Guangzhou chemical reagent factory | 1310-73-2 | |
| PEG–8000 | Sigma | P2139-250 | |
| Ph.D.-7 phage display peptide library kit | New England BioLabs | E8100S | Containing the Ph.D.-7 phage library, E. coli ER2738 host strain and M13KE control phage |
| Recombinant FGFR2 extracellular domain proteins | Sino Biological Inc. | 10824-H08H | Purity > 97% |
| Small peptide | Synthesis from GL Biochem Ltd. (Shanghai, China) | ||
| Tetracycline | Sigma | S-SHS-5 | |
| Tris | Sigma | SLF-T1503 | |
| Tween-20 | Beyotime | ST825 | |
| X-gal | Beyotime | ST912 | |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 |
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