En este estudio, presentamos estrategias basadas en inhibidores y siRNA para interferir con el flujo autofágico en las células dendríticas infectadas por el virus del herpes simple tipo-1 (HSV-1) basadas en monocitos.
El virus del herpes simple tipo-1 (HSV-1) induce la autofagia tanto en células dendríticas inmaduras (iCD) como en células dendríticas maduras (mCD), mientras que el flujo autofágico solo se observa en los iCD. Para obtener conocimientos mecánicos, desarrollamos estrategias eficientes para interferir con la rotación autofágica inducida por vhs-1. Una estrategia basada en inhibidores, para modular la autofagia inducida por VHS-1, constituye la primera opción, ya que es un método fácil y rápido. Para eludir los posibles efectos inespecíficos fuera del objetivo de estos compuestos, desarrollamos una estrategia alternativa basada en siRNA, para modular la rotación autofágica en iDCs tras la infección por VHS-1. De hecho, la electroporación de iDCs con siRNA específica FIP200 antes de la infección por VHS-1 es un método muy específico y exitoso para ablar la expresión de proteína FIP200 y así inhibir el flujo autofágico. Ambos métodos presentados dan como resultado la inhibición eficiente de la rotación autofágica inducida por VHS-1 en iDCs, por lo que la técnica basada en siRNA es más específica del objetivo. Se desarrolló un enfoque adicional basado en siRNA para silenciar selectivamente la expresión proteica de KIF1B y KIF2A, facilitando la rotación autofágica sobre la infección por VHS-1 en los mDC. En conclusión, la técnica de electroporación de siRNA representa una estrategia prometedora, para ablar selectivamente la expresión de proteínas distintas y para analizar su influencia en una infección por VHS-1.
La generación de células dendríticas derivadas de monocitos humanos (DC) constituye un modelo in vitro adecuado para estudiar las funciones y la biología de este importante tipo de células inmunitarias. El aislamiento, así como la diferenciación de monocitos en csuocitos, ha sido bien establecido en los últimos años1,2. La infección de los DC con el virus del herpes simple tipo-1 (HSV-1) del herpeszó es un sistema modelo para estudiar las modulaciones mediadas por VHS-1 de la biología de CC2,3,4,5,6 . Esto es particularmente importante para dilucidar cómo los herpesvirus amortiguan o inhiben las potentes respuestas inmunitarias antivirales, para establecer latencia en nichos inmunes privilegiados dentro del huésped7,8. En este sentido, los herpesvirus son patógenos muy exitosos que se propagan ampliamente por toda la población alcanzando una seroprevalencia de hasta el 90 % según la región geográfica9. Para entender y posiblemente prevenir esto, se requieren más información sobre las modulaciones mediadas por VHS-1 del sistema inmunitario del huésped, y especialmente de las células inmunitarias como los controladores de dominio.
Una observación completamente nueva sobre la interacción de los dCs con HSV-1 fue publicada recientemente por Turan et al.10. Los autores demostraron que la realización de la replicación del VHS-1 depende estrictamente del estado de maduración de los controladores de datos. En los iDC, la replicación completa del VhS-1 se facilita mediante mecanismos dependientes de la autofagia. Mientras que el HSV1 induce la autofagia en ambos, iDCs y mDCs, el flujo autofágico se observa sólo en iDCs. Esto a su vez facilita la salida nuclear de cápsides virales a través de la degradación autofágica de las laminas nucleares en los iDCs. Para obtener información mecanicista sobre esta vía de degradación inducida por el VHS-1 en los iDC s frente a los mDC, las estrategias nuevas y eficientes son fundamentales para investigar el flujo autofágico.
La macroautofagia (autofagia) es un proceso multipaso bien conservado dirigido a proteínas intracelulares u orgánulos enteros para la digestión lisosomal11. Simpísticamente, la autofagia se puede dividir en el (i) inicio, (ii) nucleación de membrana, (iii) expansión de la vesícula y (iv) fase de fusión autofagosoma-lisosoma12. Durante el inicio (i), componentes como el complejo de quinasa ULK1/2 activado, que contiene la proteína de interacción de la familia de quinasas de adhesión focal de 200 kD (FIP200), son fundamentales para activar el complejo beclin-1-Vps34-AMBRA1. Posteriormente, la nucleación de membranas (ii) inicia la formación de fagoforos13,que envuelve cargas citoplasmáticas marcadas por moléculas como p6214. Durante la expansión de la vesícula y la maduración autofagofórica (iii) cadena de luz proteica asociada a microtúbulos 3 (LC3)-I se convierte en su forma lipicada LC3-II que se inserta en la membrana autofagosomal. Por lo tanto, las tasas de conversión DE LC3-I a -II son un indicador de la inducción de la autofagia al reflejar la formación de autofagosomas maduros15,16. Tras la fusión autofagossomeo-lisosoma (iv), no sólo la carga autofágica, sino también las proteínas p62 y LC3-II asociadas sufren degradación (por ejemplo, por hidrólisis). Por lo tanto, la pérdida de p62 y LC3-II sirven como marcadores para el flujo autofágico17. La fusión de autofagosomas con lisosomas, y por lo tanto después de la rotación autofágica, depende en gran medida de la localización islososómica intracelular. Esto está, entre otros, regulado por los miembros de la familia kinesin a KIF1B y KIF2A, que se demostró que afectan negativamente a la fusión autofagoso-lisosoma18. Curiosamente, la expresión proteica de KIF1B y KIF2A se induce sobre la maduración de CC y, por lo que, por lo general, es responsable del flujo autofágico ineficiente en los mDC infectados por vhs,1, lo que dificulta la replicación completa del VHS-110.
Los intentos experimentales de modular la autofagia incluyen el uso de compuestos conocidos por inducir o inhibir esta vía particular19,20,21. En este estudio, describimos dos estrategias basadas en inhibidores para bloquear la rotación autofágica en iDCinfectados infectados por VHS-1. El primer compuesto utilizado en nuestros experimentos es específico y potente inhibidor de la autofagia-1 (spautina-1), que fue descrito para promover la degradación compleja beclin-1-Vps34-AMBRA1 durante la fase de iniciación de la autofagia22. El segundo compuesto utilizado en el presente estudio es la bafilomicina-A1 (BA1), un inhibidor de V-ATPase que bloquea los eventos autofágicos tardíos (esdecir, fusión autofagosoma-lisosoma, así como acidificación autolisósoma)23,24. El uso de cualquiera de estos dos inhibidores antes de la infección iDC con VHS-1 inhibe poderosamente la autofagia, pero no perturba la expresión génica viral eficiente. Por lo tanto, esta estrategia basada en inhibidores antes de la infección por VHS-1 ofrece una poderosa herramienta para inhibir el flujo autofágico inducido por VHS-1 que se puede expandir fácilmente para una plétora de diferentes tipos de células y virus, que también potencialmente inducen la autofagia.
Para superar una desventaja importante de un enfoque basado en inhibidores (esdecir, efectos fuera del objetivo inespecíficos), desarrollamos un método basado en siRNA para bloquear el flujo autofágico en iDCs (infectados por VHS-1). La técnica de la electroporación de siRNA representa una poderosa estrategia alternativa, a través de la ablación selectiva de la expresión de proteínas distintas (es decir, componentes autofágicos). En nuestros experimentos, los iCC fueron electroporados con siRNA específica de FIP200 utilizando el aparato de electroporación I (ver Tabla de Materiales)y un protocolo modificado descrito por Gerer et al. (2017) y Prechtel et al. (2007), para inhibir la autofagia durante el fase de iniciación25,26. Esta técnica nos permitió derribar específicamente la expresión FIP200 en iDCs, sin interferir con la viabilidad celular y su fenotipo inmaduro dos días después de la electroporación. Cabe destacar que la infección por VHS-1 se estableció en estos iDCs electroportados reflejados por una expresión eficaz de proteínas virales. Esta técnica basada en siRNA ofrece un beneficio único (es decir, que una variedad de diferentes componentes autofágicos, incluso en combinación), pueden ser específicamente dirigidos a la ablación de su expresión.
En este estudio, describimos además un método basado en siRNA para inducir el flujo autofágico también en los mDC infectados por VHS-1. En este caso, los iDC fueron electroporados con siRNA dirigido contra KIF1B y KIF2A antes de la maduración de CC utilizando el aparato de electroporación II (ver Tabla de Materiales). Dado que ambas proteínas están reguladas durante la maduración de CC y se sabe que regulan negativamente la fusión de autofagosomas con lisosomas10,18, su derribo indujo fuertemente el flujo autofágico en los mDC sobre la infección por VHS-1. Por lo tanto, la técnica basada en siRNA nos permitió inducir específicamente la rotación autofágica a través de interferir con la expresión de proteína KIF en los mDC, y así podría imitar sus niveles de expresión en iDCs.
En resumen, presentamos dos métodos distintos para inhibir el flujo autofágico en los iDC infectados por VHS-1. Si bien el primer enfoque basado en inhibidores constituye una forma fácil, barata y rápida de interferir con la degradación autofágica, la segunda técnica basada en siRNA es más específica y un método muy adecuado para apoyar y verificar los resultados de la Experimentos. Además, describimos un método para inducir el flujo autofágico también en los mDC infectados por VHS-1, a través del derribo mediado por siRNA de dos proteínas KIF.
El alcance del presente protocolo incluye (i) el manejo de iDCs derivados de monocitos humanos, así como de los CPD, (ii) su infección por VHS-1, (iii) su tratamiento con compuestos conocidos por inhibir la autofagia, y (iv) su electroporación con siRNA utilizando dos diferentes configuraciones técnicas. Usando el presente protocolo, el flujo autofágico puede bloquearse en los iDC infectados por el VHS-1 o inducido en los mDC infectados por el VHS-1.
Dado que los dC, y especialmente los iDC, son células muy vulnerables, trabajar con estas células implica pasos bastante delicados. Para la generación de DC, recomendamos utilizar PBMC recién aislados, y para evitar su criopreservación, con el fin de obtener mayores rendimientos celulares. Además, al manipular iDCs durante los experimentos, incluyendo su posterior cultivo, evitar alteraciones de temperatura severas o prolongadas. De lo contrario, los iDC podrían sufrir cambios fenotípicos y, por lo tanto, es necesario verificar su fenotipo inmaduro mediante citometría de flujo. Tenga en cuenta que, a diferencia de sus homólogos maduros, los iDC carecen de marcadores distintos, como CD80, CD83 y CD8628,29. La infección de iDCs y mDCs con HSV-1 es un método bien establecido2,3,4,5,6,10. Nosotros y otros mostramos que los CC son altamente susceptibles para la infección por VHS-1, cuando se ha utilizado un MOI de 1 o 2(Figura 2). En nuestras manos, mantener el volumen del medio de infección en niveles bajos (1-3 x 106 células en 250-350 l) conducirá a una mejor eficiencia de la infección.
Un enfoque clásico para interferir con una determinada vía celular distinta es el uso de compuestos específicos. Una variedad de diferentes moduladores de la autofagia, es decir, activadores, así como inhibidores, están disponibles actualmente30. En lo que respecta a la autofagia inducida por el VHS-1 en los cc. estas condiciones, Turan et al., (2019) mostraron recientemente los efectos inhibitorios de la espantina-1 y la bafilomicina-A1 (BA1) en la rotación autofágica en los iDC10. Esta técnica para la inhibición de la autofagia es adecuada para la combinación con una infección posterior de VHS-1, ya que ni la tasa de infección ni el estado de maduración de los CC (especialmente los iDC) están deteriorados. En futuras aplicaciones, este enfoque basado en inhibidores podría aplicarse también en combinación con otros agentes infecciosos, condiciones de estrés, como el hambre, así como para diferentes tipos de células. Sin embargo, cuando se utilizan inhibidores, surgen limitaciones en la determinación de la concentración adecuada para la inhibición eficiente de la autofagia, sin afectar gravemente a la viabilidad celular. La principal limitación cuando se utilizan inhibidores es, sin embargo, la aparición de posibles efectos fuera del objetivo o adversos, que podrían conducir a resultados engañosos31,32.
El segundo enfoque para interferir con la autofagia, cubierto en el presente protocolo, es el derribo específico utilizando siRNA33,34,35. Por un lado, utilizamos el aparato de electroporación I para ablar específicamente la expresión de FIP200, inhibiendo así la rotación autofágica inducida por HSV-1 en iDCs. Por otro lado, silenciamos dos proteínas KIF diferentes (es decir, KIF1B y KIF2A), utilizando el aparato de electroporación II, para facilitar el flujo autofágico en los mCC infectados por el VHS-1. Tanto los protocolos de electroporación dieron lugar a una ablación casi completa de FIP200 en iDCs, como de KIF1B/KIF2A en mDCs, que se verificó mediante análisis de manchas occidentales(Figura 4A, Figura 5A). A diferencia del aparato de electroporación I, que no afecta a la viabilidad de los CC, la electroporación de los mCD utilizando el aparato de electroporación II da lugar a tasas ligeramente más altas de células muertas(Figura 4B, Figura 5B ). Por lo tanto, en futuras aplicaciones, el aparato de electroporación que debería utilizar preferentemente tanto para iDCs como para mDCs. Sorprendentemente, ambas técnicas basadas en siRNA, para modular el flujo autofágico, son compatibles con la infección posterior de HSV-1 de iDCs o mDCs. Además, ni el fenotipo inmaduro de los iDCniel o el fenotipo maduro de los mDCs se altera después de la electroporación.
La electroporación de iDCs que utilizan siRNA específica de FIP200 es un método eficiente y altamente específico para el derribo de genes, así como la inhibición del flujo autofágico sobre la infección por VHS-1. Además del silenciamiento específico de FIP200, este protocolo se puede adaptar para silenciar otros componentes autofágicos, participando en diferentes pasos durante la cascada autofágica. Sin embargo, la identificación del objetivo adecuado para la inhibición eficiente de la autofagia mediada por siRNA incluye varios aspectos de preocupación. En primer lugar, la eficiencia de derribo de genes relacionados con la autofagia (ATG) no necesariamente se correlaciona positivamente con la inhibición eficiente de la autofagia y es altamente dependiente de la proteína ATG específica que se silencia36. En segundo lugar, las proteínas ATG distintas están involucradas adicionalmente en vías distintas de la autofagia, por lo que su ablación también podría conducir a efectos secundarios adversos37,38,39. En tercer lugar, los diferentes ATG pueden tener funciones redundantes, por lo que el derribo de un componente puede no ser suficiente para inhibir la autofagia (porejemplo, beclin-1 y beclin-2)40.
Además, el aparato de electroporación I -basado en el protocolo de electroporación de dCs también es adecuado para ARNm, y podría ser utilizado para una variedad de tipos de células primarias adicionales, tales como PBMCs25. Este sistema proporciona así una estrategia general para entregar diferentes especies de ARN en diferentes tipos de células primarias. En conclusión, presentamos dos protocolos para inhibir el flujo autofágico, ya sea mediante el uso de un enfoque basado en inhibidores o siRNA combinado con la infección posterior de HSV-1 de los iDC. Además, describimos un enfoque de electroporación de siRNA para inducir el flujo autofágico en los mDCs sobre la infección por VHS-1.
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por el Consejo Alemán de Investigación (DFG) a través del proyecto STE 432/11-1 otorgado a AS y por el Programa ELAN de la Facultad de Medicina (Friedrich-Alexander-Universitat Erlangen-Núremberg) a través del proyecto 18-12-21-1, otorgado a LG.
4D-Nucleofector Core Unit (electroporation apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | AAF-1002B | |
AB-Serum | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | H4522 | Dendritic cell cultivation |
ACD-A | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | 9007281 | |
Amaxa P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit L (electroporation kit apparatus II) | Lonza (Basel, Switzerland) | V4XP-3024 | |
Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagent | GE Healthcare (Solingen, Germany) | RPN2232 | Western Blot Detection |
Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | A3678 | |
anti-mouse-IgG (mouse, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7076 | Western Blot detection |
anti-rabbit-IgG (goat, polyclonal, HRP) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 7074 | Western Blot detection |
Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | tlrl-baf1 | inhibition of autophagy and lysosomal degradation |
BD FACS Canto II Flow Cytometer | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 338962 | |
Benzonase | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | E1014 | |
Blotting Chamber Fastblot B44 | Biometra (Göttingen, Germany) | 846-015-100 | |
CCR7 (mouse, Pe-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 557648 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: G043H7 |
CD11c (mouse, Pe-Cy5) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 561692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: B-ly6 |
CD14 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555398 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: M5E2 |
CD3 (mouse, FITC) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 555332 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: UCHT1 |
CD80 (mouse, V450) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 560442 | Flow cytometry Dilution: 1:100 Clone: L307.4 |
CD83 (mouse, APC) | eBioscience Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 17-0839-41 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: HB15e |
CD86 (mouse, PE) | BD Biosciences (Heidelberg, Germany) | 553692 | Flow cytometry Dilution: 1:100 |
EVOS FL Cell Imaging | System AMG/Life Technologies (Carlsbad, USA) | AMF4300 | |
FIP200 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 12436 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D10D11 |
GAPDH (mouse) | Merck Millipore (Massachusetts, USA) | AB2302 | Western Blot detection Dilution: 1:5000 Clone: MAB374 |
Gene Pulser II apparatus (electroporation apparatus I) | BioRad Laboratories GmbH (München, Germany) | 165-2112 | |
GM-CSF (4×104 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-868 | |
HLA‐DR (mouse, APC-Cy7) | BioLegend (Fell, Germany) | 307618 | Flow cytometry Dilution: 1:200 Clone: L243 |
HSV-1/17+/CMV-EGFP/UL43 | BioVex | DC infection |
|
ICP0 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-53070 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 11060 |
ICP5 (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-56989 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: 3B6 |
IL-1β (0.1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1411-050 | |
IL-4 (1×106 U/mL) | Miltenyi Biotec (Bergisch Gladbach, Germany) | 130-093-924 | |
IL-6 (1×106 U/mL) | Cell Genix GmbH (Freiburg, Germany) | 1404-050 | |
ImageQuant LAS 4000 | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 28955810 | |
KIF1B (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-376246 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: E-12 |
KIF2A (mouse) | Santa Cruz Biotechnology (St. Cruz; Dallas, Texas, USA) | sc-271471 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D-7 |
LC3B (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 3868 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D11 |
L-glutamine | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-605E | |
LIVE/DEAD Fixable Violet dead cell stain kit | Life Technologies (Carlsbad, CA, USA) | L34964 | L/D staining in Flow cytometry |
Lymphoprep | Alere Technologies AS (Oslo, Norway) | 04-03-9391/01 | |
Magnesiumchloride | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A537.1 | |
Megafuge 2.0 RS | Heraeus (Hanau, Germany) | 75015505 | |
N, N, N', N'-Tetramethylethylendiamine (TEMED) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T9281 | |
Neubauer counting chamber | Brand (Wertheim, Germany) | 717805 | |
Nunc Cell culture flasks (175.0 cm2) | Thermo Scientific (Rockford, USA) | 159910 | |
p62 (rabbit) | Cell Signaling (Leiden, Netherlands) | 88588 | Western Blot detection Dilution: 1:1000 Clone: D5L7G |
PageRuler prestained protein ladder | Thermo Fisher Scientific (Langenselbold, Germany) | 26616 | |
Paraformaldehyde, 16 % | Alfa Aesar, Haverhill, USA | 43368.9M | |
PerfectSpin 24 Plus | Peqlab (Erlangen, Germany) | C2500-R-PL | |
PGE2 (1 mg/mL) | Pfizer (Berlin, Germany) | BE130681 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Lonza (Basel, Switzerland) | 17-512F | |
Protein gel system MiniProtean II | Bio-Rad Laboratories GmbH (München, Germany) | 1652960 | |
RestoreTM Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific, Rockford, USA | 21059 | |
Rocking Platform wt 15 | Biometra (Göttingen, Germany) | 042-590 | |
RotiBlock | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | A151.4 | |
Roti-Load 1 (4x) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | K929.3 | |
Rotiphorese Gel 30 (37.5:1) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 3029.1 | |
RPMI 1640 | Lonza (Basel, Switzerland) | 12-167F | |
Sodium dodecyl Sulfate (SDS) | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 2326.2 | |
Thermomixer comfort | Eppendorf (Hamburg, Germany) | 5355 000.011 | |
TNF-α (10 μg/mL) | Peprotech (Hamburg, Germany) | 300-01A | |
Tris | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 4855.3 | |
Trypan blue solution (0.4 %) | Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Steinheim, Germany) | T8154 | |
Tween 20 | Carl Roth GmbH (Karlsruhe, Germany) | 9127.1 | |
Whatman 0.2 μm nitrocellulose membrane | GE Healthcare (Solingen, Germany) | 10600001 | |
WhatmanTM Chromatography Paper 3 mm Chr | Fisher Scientific GmbH (Schwerte, Germany) | 3030917 |