我们描述了一种体内方法,通过使用心肌心肌的心肌毒素介导损伤和自交付siRNA的注射的组合,研究卫星细胞中特定基因的功能损失。
骨骼肌具有巨大的能力,在受伤后再生。这个过程主要是由肌肉干细胞,也称为卫星细胞驱动。卫星细胞的特点是转录因子Pax7的表达及其在休息骨骼肌的基底层下的位置。受伤时,卫星细胞被激活,进行自我更新或分化,形成新的肌纤维或与受损细胞融合。利用骨骼肌心肌心肌心肌心肌毒素损伤模型,可以研究体内卫星细胞的功能。为了研究一个基因在骨骼肌再生过程中的功能,主要使用转基因小鼠模型。在这里,我们提出了转基因小鼠的替代方法,以研究卫星细胞在再生过程中的基因功能,例如,在转基因小鼠不可用的情况下。我们将特定骨骼肌的心肌毒素介导损伤与将自我传递的siRNA注射到再生肌肉中,然后由卫星细胞在其他细胞中接受。因此,我们提供了一种方法,分析卫星细胞在生理条件下再生过程中的基因功能,无需转基因小鼠。
骨骼肌是身体最大的组织,约占总体重的40%,支持自愿运动。骨骼肌的组织结构主要由后密体、终位分化、多核化肌纤维以及周围神经系统、血管系统和间质细胞1的各种其他细胞组成。重要的是,骨骼肌具有巨大的能力,以再生和恢复功能时受伤或损伤2。这个过程取决于组织驻留肌肉干细胞又称卫星细胞3,4。卫星细胞位于肌纤维和基底层之间,其特征是转录因子Pax75,6,7的表达。在静息条件下,卫星细胞是静止的,但由于创伤性损伤而激活,例如,通过偏心运动或通过注射蛇毒心毒素6、8进行实验。一旦激活,Pax7阳性卫星细胞共同表达MyoD和Myf5,使干细胞进入造血分化。卫星细胞抵制承诺因素的向上调节,将保留其干细胞潜力,并恢复静止,以补充干细胞库以满足未来需求。在造血原前体池膨胀后,转录网络被异构因子(如Myogenin)激活,从而启动细胞周期退出和终端分化。这些肌体原体然后相互融合或与现有的肌纤维融合,从而促进肌核,以保持肌核域的大小。肌纤维表达末期肌肉分化基因,如肌辛重链。最后,新形成的肌纤维生长成熟,建立骨骼肌9、10的功能单元。
骨骼肌的再生可能受各种条件的影响,包括肌肉疾病或老化11,12,从轻度损伤到威胁生命的情况,例如 Duchenne 肌肉营养不良13,14.因此,再生医学旨在通过瞄准卫星细胞功能15、16,利用其固有的再生能力,恢复受损或出现故障的骨骼肌组织。为了充分发挥其潜力,需要在骨骼肌再生期间全面了解卫星细胞的内源性。虽然存在实验方法分离卫星细胞,其附近的肌纤维17,卫星细胞及其环境的细胞和系统相互作用的全部复杂性只能在体内重新概括。在这方面,关于骨骼肌再生的很大知识已经获得使用小鼠损伤模型2,18。
这里我们介绍了一个特定的实验小鼠损伤模型,以研究心肌毒素引起的体内肌肉损伤的干细胞介导再生。心毒素,一种蛇衍生的细胞解毒毒素,导致肌纤维脱极化和坏死,被注射到前肌中,进而引发组织退化,然后再生。为了分析基因在急性再生过程中的功能,在损伤后的第3天,在卫星细胞扩张的高峰期注射自传递siRNA。实验动物在不同时间点被牺牲,并收集前肌。解剖的肌肉被冷冻和处理,以进一步冷冻切片。免疫荧光显微镜然后用于分析再生标记。该方法允许使用野生型小鼠在卫星细胞驱动骨骼肌肉再生期间研究单个基因的功能。
在这里,我们提出了一种方法,以研究特定基因在骨骼肌再生过程中的功能,而无需转基因动物。这是通过心肌毒素诱发肌肉损伤与在受伤后的第3天将自我传递的siRNA注射到再生骨骼肌的组合。我们详细描述了心肌毒素的肌肉损伤过程、自交付siRNA的注射和收获肌肉的处理,以分析再生的进度。我们证明,将蛇毒心肌毒素注射到骨骼肌中会有效地伤害整个肌肉,并且在注射到骨骼肌两天后,在其它细胞类型中,大约75%的卫星细胞中发现自我传递的siRNA。再生骨骼肌(图4,图5)。
应特别注意前肌的同质损伤,因为不同程度的损伤会影响再生结果,从而也会影响 siRNA 的影响。此外,将整个再生区域注入自交付的siRNA至关重要。对于再生过程的分析,建议始终比较再生骨骼肌的类似区域,因此,前肌应切成两半,以始终比较肌肉的中腹区域。在分析肌肉时,需要分析整个冷冻节,因为肌纤维组成在前肌中不同,因此可能以不同的方式再生。
卫星细胞的功能可以通过各种实验程序来研究,包括其在相邻的分离单肌纤维17上的培养,通过移植和分析诱导损伤后骨骼肌的再生18,19.利用体内诱导损伤模型(例如,注射心肌毒素)调查卫星细胞的功能,通过分析卫星细胞功能的能力,也能够分析卫星细胞与其他细胞类型(如巨噬细胞和调查系统因素的影响2。骨骼肌的损伤可以通过各种方式完成,例如,偏心运动,冷冻损伤,注射BaCl2或注射蛇毒,如心毒素或注意辛18。虽然偏心运动可能是最生理损伤的方法,但一个特定肌肉的损伤只有20个。当卫星细胞向损伤部位迁移是研究目的,或者只有肌肉的特定部分应受伤时,可以应用冻结损伤。在实验中,冻伤的缺点是需要进行开手术才能应用预冷金属探头。注射BaCl2或蛇毒是最具戏剧性的伤害方法,因此对卫星细胞功能的挑战最大。此外,注射是微创的,手术时间,一般是少于五分钟,不涉及缝合等,从而尽量减少感染的风险。
肌肉损伤主要用于研究失去基因功能的功能后果,例如,Pax77,21。特别是如果老年小鼠是科学问题的焦点,转基因小鼠的产生或使用往往不可行。注射针对特定基因的自传递siRNA是这些情况下的可行替代品,并已成功使用22。简而言之,小鼠的前肌因注射心肌毒素而受伤,在受伤后的第3天注射了针对纤维蛋白(FN)的自送siRNA。损伤10天后对肌肉进行了分析,在siFN与炒siRNA对照条件下观察到卫星细胞数量显著减少。在siRNA注射后2天通过定量实时PCR在全肌肉分解中确定敲除效率,表达水平降低58%,表明输送和敲除效率足以发挥作用分析22.测试击倒效率的替代方法是免疫球体或免疫荧光分析,带有针对目标基因的抗体。在注射小鼠之前,应确定用于体内注射的siRNA的效率和特异性,例如,通过测试分离的卫星细胞或原发性细胞的效率。使用由 4 种不同的 siRNA 和单个 siRNA 组成的智能池可提高击倒效率,但也会增加非特定定位的风险。所有使用siRNA序列的特异性应在细胞培养中测试,以避免脱靶效应。作为一种控制,应使用非靶向的炒siRNA,因为注射siRNA本身可能会影响由于注射的再生过程,从而对肌肉造成额外的损伤。注射siRNA的时间点取决于科学问题和靶基因的表达特征。一般来说,在心肌毒素损伤后的第3天注射自交付性siRNA,目标是大多数对卫星细胞增殖至关重要的基因,因为卫星细胞增殖在损伤后的第3天左右达到高峰。第一次siRNA注射的时间点不应少于48小时后,心毒素损伤,因为心肌毒素的注射量相当高,在向肌肉注入额外的溶液之前,应该对液体进行重新吸收。一般来说,多次注射siRNA或不同siRNA的组合是可能的,虽然人们必须考虑每次注射到再生肌肉是造成额外的损害。
所述方法的一个局限性是,观察到的效果不一定只取决于卫星细胞中目标基因的敲除,而是可能归因于其他细胞类型,如免疫细胞或纤维化祖细胞。因此,有必要将这些实验与研究纯卫星细胞群的实验结合起来。人们可以使用浮肌纤维培养物进行实验,在相邻的肌纤维上培养卫星细胞,或者使用孤立的卫星细胞进行移植实验。
注射自传递siRNA的替代方法是注射小分子抑制剂或重组蛋白,可以执行,这取决于科学问题。例如,在15、16岁的小鼠中成功地注射了JAK/STAT信号的细胞外基质蛋白纤维蛋白或小分子抑制剂。只有在使用诱导的遗传小鼠模型,才能在骨骼肌再生(例如卫星细胞)期间分析某一特定细胞类型的特定基因功能。注射自交付的siRNA、重组蛋白或小分子抑制剂可能会影响再生骨骼肌的多种细胞类型。
The authors have nothing to disclose.
作者声明没有相互竞争的经济利益。
isoflurane | Henry Schein | Isothesia | inhalation narcotics |
Hot Plate 062 | Labotect | 13854 | |
Anesthesia System (Tec 7) with inhalation box + nose masks | Tem Sega | Minihub | |
shaver for rodents | isis | GT420 | |
cardiotoxin | Latoxan | L8102 | snake venom needed for muscle injury |
Accell siRNA smart pool | Dharmacon | depending on your target gene | self delivering siRNA |
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-21206 | secondary antibody |
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher | A-21123 | secondary antibody |
Coverslips | VWR | 631-1574 | |
CV Mount | Leica | 14046430011 | mounting medium for immunohistochemistry |
DAPI | Sigma Aldrich | D9542 | nuclear staining |
devMHC antibody | DHSB | F.1652 | |
Eosin Y | Thermo Fisher | 73104 | |
Haematoxylin Gill No3 | Sigma-Aldrich | GHS316-500ML | |
insulin syringe (29g) | Terumo | 3SS05M2813 | syringue used for muscle injections |
laminin antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
M.O.M blocking reagent | Vector labs | MKB-2213 | blocking for immunofluorescent staining |
Meloxicam | Boehringer Ingelheim | Metacam | analgesics |
OCT | Thermo Fisher | 6502 | tissue embedding |
Pax7 antibody | DSHB | PAX7 | satellite cell specific antibody |
ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Fisher | P36934 | aequos mounting medium |
Sucrose | Carl Roth | 4621.1 | tissue embedding |
Superfrost plus | Thermo Scientific | J1830AMNZ | microscope slides |
TritonX-100 | Amresco | 0694-1L | permeabilization reagent |
Dissection tools | |||
Dumont 5, straight | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Dumont 7, curved | Fine Science Tools | 11272-40 | |
Extra fine Bonn scissors (cutting edge: 13 mm) | Fine Science Tools | 14084-08 | |
Narrow pattern forceps | Fine Science Tools | 11002-16 | |
Spring scissors (cutting edge: 5 mm, tip diameter: 0.35 mm) | Fine Science Tools | 91500-09 |