التصوير النانوسكوبي لأقسام الأنسجة البشرية عن طريق التوسع البدني والنظائري
Summary
التصوير بالنانو لعينات الأنسجة السريرية يمكن أن يحسن فهم مسببات الأمراض. علم أمراض التوسع (ExPath) هو نسخة من الفحص المجهري التوسع (ExM)، المعدلة للتوافق مع عينات الأنسجة السريرية القياسية، لاستكشاف التكوين نانوي النطاق من الجزيئات الحيوية باستخدام المجاهر الانعراج التقليدية محدودة.
Abstract
في علم الأمراض الحديثة، المجهرية البصرية يلعب دورا هاما في تشخيص المرض من خلال الكشف عن الهياكل المجهرية للعينات السريرية. ومع ذلك، فإن الحد الأساسي للانعراج البدني يمنع استجواب التشريح النانومتري والتغيرات المرضية الدقيقة عند استخدام نهج التصوير البصري التقليدية. هنا، ونحن نصف بروتوكول بسيط وغير مكلفة، ودعا علم الأمراض التوسع (ExPath)، للتصوير البصري نانوالنطاق من الأنواع الشائعة من عينات الأنسجة الأولية السريرية، بما في ذلك كل من البارافين الثابتة المجمدة أو الرسمية الثابتة جزءا لا يتجزأ من (FFPE) المقاطع. هذه الطريقة تتحايل على حد الانعراج البصري عن طريق تحويل عينات الأنسجة كيميائيا إلى هجين الأنسجة هيدروجيل وتوسيعها جسديا متساوي استوائي عبر جداول متعددة في المياه النقية. بسبب التوسع، يتم فصل جزيئات غير قابلة للحل سابقا، وبالتالي يمكن ملاحظتها باستخدام المجهر البصري التقليدي.
Introduction
التحقيق في التنظيم الجزيئي للأنسجة في سياق ثلاثي الأبعاد (3D) يمكن أن توفر فهما جديدا للوظائف البيولوجية وتطوير الأمراض. ومع ذلك، فإن هذه البيئات النانومترية تتجاوز قدرات الدقة للمجاهر الانعراج التقليدية المحدودة (200-300 نانومتر)، حيث يتم تعريف الحد الأدنى من المسافة القابلة للحل، d بواسطة d <!–
–> αי/NA. هنا هو الطول الموجي للضوء وNA هو الفتحة العددية (NA) من نظام التصوير. في الآونة الأخيرة، أصبح التصور المباشر للجزيئات ذات العلامات الفلورية ممكناً من خلال تقنيات التصوير فائقة الدقة المطورة حديثاً1و2و3،بما في ذلك استنفاد الانبعاثات المحفز (STED)، التصوير المنشط التعريب المجهري (PALM)، الفحص المجهري لإعادة البناء البصري العشوائي (STORM)، والفحص المجهري للإضاءة المنظمة (SIM). على الرغم من أن تقنيات التصوير هذه قد أحدثت ثورة في فهم الوظيفة البيولوجية على النطاق النانوي، إلا أنها تعتمد في كثير من الأحيان على معدات باهظة الثمن و/أو متخصصة وخطوات معالجة الصور، يمكن أن يكون لها وقت اقتناء أبطأ مقارنة بـ التصوير البصري التقليدي، تتطلب الفلوروفورس مع خصائص محددة (مثل القدرة على تبديل الصور و / أو ارتفاع استقرار الصورة). وبالإضافة إلى ذلك، لا يزال من الصعب إجراء التصوير ثلاثي الأبعاد فائق الدقة على عينات الأنسجة.
توسيع المجهرية (ExM)، التي أدخلت لأول مرة في عام 20154،ويوفر وسيلة بديلة للتصوير الميزات نانوية (<70 نانومتر) عن طريق توسيع جسديا العينات المحفوظة جزءا لا يتجزأ من هيدروجيل متعدد الكهرباء قابل للتضخم. هنا، يتم تثبيت الجزيئات الحيوية الرئيسية و/أو التسميات في الموقع إلى شبكة بوليمر يمكن توسيعها بالتساوي الموضعي بعد المعالجة الكيميائية. ولأن التوسع المادي يزيد من الدقة الفعالة الكاملة، يمكن عندئذ حل جزيئات الاهتمام باستخدام أنظمة التصوير التقليدية المحدودة الانعراج. منذ نشر البروتوكول الأصلي، حيث تم تثبيت التسميات الفلورية توليفها مخصصة لشبكة البوليمر4،وقد استخدمت استراتيجيات جديدة لإرساء البروتينات مباشرة (الاحتفاظ بالبروتين ExM، أو proExM)5، 6،7،8،9 وRNA9،10،11،12 إلى هيدروجيل، وزيادة التكبير البدني من خلال التكراري التوسع13 أو تكييف هلام الكيمياء8،14،15.
هنا نقدم نسخة مكيفة من proExM، ودعا علم الأمراض التوسع (ExPath)16، والتي تم تحسينها لصيغ علم الأمراض السريرية. يحول البروتوكول العينات السريرية، بما في ذلك البارافين الممزوج بالقطع ى الشكل (FFPE)، والهيماتوكسيلين وإيوسين (H&E) الملون، وعينات الأنسجة البشرية المجمدة الطازجة المثبتة على الشرائح الزجاجية، إلى حالة متوافقة مع ExM. ثم يتم تثبيت البروتينات إلى هيدروجيل ويتم تنفيذ التجانس الميكانيكية (الشكل 1)16. مع التوسع الخطي 4 أضعاف من العينات، يمكن الحصول على صور فائقة الدقة متعددة الألوان (~ 70 نانومتر) باستخدام المجهر البؤري التقليدي وجود فقط قرار ~ 300 نانومتر، ويمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من تقنيات التصوير فائقة الدقة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، نقدم بروتوكول ExPath16، وهو متغير من proExM5 التي يمكن تطبيقها على الأنواع الأكثر شيوعا من عينات خزعة السريرية المستخدمة في علم الأمراض، بما في ذلك FFPE، H & E الملون، والعينات المجمدة حديثا على الشرائح الزجاجية. يتبع تحويل التنسيق واسترجاع المستضد وتلطيخ العينات للع?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم هذا العمل من قبل صندوق بدء الكلية من جامعة كارنيجي ميلون (YZ) وجائزة مدير المعهد الوطني للصحة للمبتكرين الجدد (DP2 OD025926-01 إلى YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
