Nanoskopisk billeddannelse af humane vævs sektioner via fysisk og isotropisk ekspansion
Summary
Nanoskala-billeddannelse af kliniske vævsprøver kan forbedre forståelsen af sygdoms patogenesen. Ekspansion patologi (expath) er en version af ekspansion mikroskopi (exm), modificeret for kompatibilitet med standard kliniske vævsprøver, at udforske nanoskala konfiguration af biomolekyler ved hjælp af konventionelle diffraktion begrænset mikroskoper.
Abstract
I moderne patologi, Optisk mikroskopi spiller en vigtig rolle i sygdoms diagnose ved at afsløre mikroskopiske strukturer af kliniske prøver. Men den grundlæggende fysiske diffraktion grænse forhindrer forhør af nanoskala anatomi og subtile patologiske forandringer, når du bruger konventionelle optiske Imaging tilgange. Her beskriver vi en enkel og billig protokol, kaldet ekspansions patologi (ExPath), til optisk billeddannelse i nanoskala af almindeligt forekommende typer af kliniske primær vævsprøver, herunder både fastfrosset eller formalin-fast paraffinindlejret (FFPE) væv Sektioner. Denne metode omgår den optiske diffraktions grænse ved kemisk omdannelse af vævsprøverne til vævs-hydrogel hybrid og fysisk udvidelse af dem isotropisk på tværs af flere skalaer i rent vand. På grund af ekspansion adskilles tidligere opløselige molekyler og kan derfor observeres ved hjælp af et konventionelt optisk mikroskop.
Introduction
Undersøge den molekylære organisering af væv i en tredimensionel (3D) kontekst kan give ny forståelse af biologiske funktioner og sygdomsudvikling. Disse nanoskala-miljøer ligger dog uden for opløsnings mulighederne i konventionelle diffraktions begrænsede mikroskoper (200 − 300 nm), hvor den minimale afstand, d er afgrænset af d α <!–
–> λ/na. Her λ er lysets bølgelængde og na er den numeriske blænde (Na) af billed systemet. For nylig er direkte visualisering af fluorescently mærkede molekyler blevet muliggjort af nyudviklede super opløsnings billedbehandlings teknikker1,2,3, herunder stimuleret udtynding af udledningen (sted), foto-aktiveret lokalisering mikroskopi (PALM), stokastiske optisk genopbygning mikroskopi (STORM), og struktureret belysning mikroskopi (SIM). Selv om disse billeddiagnostiske teknikker har revolutioneret forståelsen af biologisk funktion på nanoskalaen, i praksis, de ofte er afhængige af dyre og/eller specialiseret udstyr og billedbehandling trin, kan have langsommere erhvervelse tid sammenlignet med konventionel optisk billeddannelse, kræver fluorophorer med særlige karakteristika (såsom foto-switching kapacitet og/eller høj foto stabilitet). Desuden er det fortsat en udfordring at udføre 3D super-resolution Imaging på vævsprøver.
Udvidelses mikroskopi (ExM), der først blev introduceret i 20154, giver et alternativt middel til nanoskala funktioner (< 70 nm) ved fysisk ekspanderende konserverede prøver indlejret i en swellable polyelektrolyt hydrogel. Her er vigtige biomolekyler og/eller etiketter forankret på stedet til et polymer netværk, der kan udvides isotopisk efter kemisk behandling. Fordi den fysiske ekspansion øger den samlede effektive opløsning, kan molekyler af interesse derefter løses ved hjælp af konventionelle diffraktion-begrænsede billedbehandlingssystemer. Siden offentliggørelsen af den oprindelige protokol, hvor brugerdefinerede syntetiseret fluorescerende etiketter blev forankret til polymer netværk4, nye strategier er blevet brugt til direkte anker proteiner (protein retention exm, eller proexm)5, 6,7,8,9 og RNA9,10,11,12 til hydrogel, og øge fysiske forstørrelse gennem iterativ udvidelse13 eller tilpasning af gel-kemi8,14,15.
Her præsenterer vi en tilpasset version af proExM, kaldet ekspansion patologi (ExPath)16, som er blevet optimeret til kliniske patologiske formater. Protokollen omdanner kliniske prøver, herunder formalin-fast paraffin-indlejret (FFPE), hematoxylinlegemer og eosin (H & E) farvede, og fersk frosne humane vævsprøver monteret på glas glider, ind i en tilstand, der er kompatibel med ExM. Proteiner er derefter forankret til hydrogel og mekanisk homogenisering udføres (figur 1)16. Med en 4-fold lineær udvidelse af prøverne, Flerfarvet super opløsning (~ 70 nm) billeder kan opnås ved hjælp af en konventionel Konfokal mikroskop har kun en ~ 300 Nm opløsning og kan også kombineres med andre super-resolution Imaging teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her præsenterer vi ExPath Protocol16, en variant af proExM5 , der kan anvendes på de mest almindeligt forekommende typer af kliniske biopsiprøver, der anvendes i PATOLOGI, herunder ffpe, H & E farvede, og fersk frosne prøver på glas skred. Format konvertering, antigen hentning og immunofarvning af prøverne følger almindeligt anvendte protokoller, der ikke er specifikke for ExPath. I modsætning til den oprindelige proExM protokol9, er expath a…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af fakultetets opstartsfond fra Carnegie Mellon University (YZ) og NIH Director’s nye innovator Award (DP2 OD025926-01 til YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
