Imagerie nanoscopique des sections de tissus humains par l'expansion physique et isotropique
Summary
La formation image à l’échelle nanométrique d’échantillons de tissus cliniques peut améliorer la compréhension de la pathogénie de la maladie. La pathologie d’expansion (ExPath) est une version de la microscopie d’expansion (ExM), modifiée pour la compatibilité avec les échantillons cliniques standard de tissu, pour explorer la configuration nanométrique des biomolécules utilisant des microscopes limités de diffraction conventionnelle.
Abstract
Dans la pathologie moderne, la microscopie optique joue un rôle important dans le diagnostic de la maladie en révélant des structures microscopiques de spécimens cliniques. Cependant, la limite fondamentale de diffraction physique empêche l’interrogation de l’anatomie à l’échelle nanométrique et les changements pathologiques subtils lors de l’utilisation d’approches conventionnelles d’imagerie optique. Ici, nous décrivons un protocole simple et peu coûteux, appelé pathologie d’expansion (ExPath), pour l’imagerie optique à l’échelle nanométrique des types communs de spécimens cliniques de tissu primaire, y compris le tissu incorporé de paraffine fixe-congelée ou formalin-fixe (FFPE) Sections. Cette méthode contourne la limite de diffraction optique en transformant chimiquement les échantillons de tissus en hybride tissu-hydrogel et en les élargissant physiquement isotropically à travers de multiples échelles dans l’eau pure. En raison de l’expansion, les molécules précédemment insolubles sont séparées et peuvent donc être observées à l’aide d’un microscope optique conventionnel.
Introduction
L’étude de l’organisation moléculaire des tissus dans un contexte tridimensionnel (3D) peut fournir une nouvelle compréhension des fonctions biologiques et du développement de la maladie. Cependant, ces environnements à l’échelle nanométrique sont au-delà des capacités de résolution des microscopes à diffraction conventionnelle limitée (200 à 300 nm), où la distance minimale résolvable, d est définie par d <!–
–> ‘/NA. Voici la longueur d’onde de la lumière et NA est l’ouverture numérique (NA) du système d’imagerie. Récemment, la visualisation directe des molécules étiquetées fluorescentes a été rendue possible grâce aux techniques d’imagerie super-résolution nouvellement développées1,2,3, y compris l’épuisement des émissions stimulées (STED), microscopie de localisation photo activée (PALM), microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et microscopie structurée d’éclairage (SIM). Bien que ces techniques d’imagerie aient révolutionné la compréhension de la fonction biologique à l’échelle nanométrique, dans la pratique, elles reposent souvent sur des équipements coûteux et/ou spécialisés et des étapes de traitement d’image, peuvent avoir plus peu de temps d’acquisition que l’imagerie optique conventionnelle, nécessitent des fluorophores ayant des caractéristiques spécifiques (comme la capacité de commutation de photo et/ou une photostabilité élevée). En outre, il reste un défi d’effectuer l’imagerie 3D super-résolution sur des spécimens de tissus.
La microscopie d’expansion (ExM), introduite pour la première fois en 20154, fournit un autre moyen d’imagerie des caractéristiques à l’échelle nanométrique (70 nm) en élargissant physiquement les échantillons conservés incorporés dans un hydrogel polyélectrolyte enflé. Ici, les biomolécules clés et/ou les étiquettes sont ancrées in situ à un réseau de polymères qui peut être isotopiquement étendu après traitement chimique. Parce que l’expansion physique augmente la résolution effective totale, les molécules d’intérêt peuvent alors être résolues en utilisant des systèmes d’imagerie conventionnels à diffraction limitée. Depuis la publication du protocole original, où les étiquettes fluorescentes synthétisées personnalisées ont été ancrées au réseau de polymères4, de nouvelles stratégies ont été utilisées pour ancrer directement les protéines (rétention de protéines ExM, ou proExM)5, 6,7,8,9 et RNA9,10,11,12 à l’hydrogel, et augmenter le grossissement physique par itératif expansion13 ou l’adaptation de la chimie gel8,14,15.
Ici, nous présentons une version adaptée de proExM, appelé pathologie d’expansion (ExPath)16, qui a été optimisé pour les formats de pathologie clinique. Le protocole convertit les échantillons cliniques, y compris les échantillons de paraffine fixe synéral fixe s’est métastatique (FFPE), l’hématoxylin et l’éosine (H-E) tachés, et les échantillons de tissus humains fraîchement congelés montés sur des lames de verre, en un état compatible avec LM. Les protéines sont ensuite ancrées à l’hydrogel et l’homogénéisation mécanique est effectuée (Figure 1)16. Avec une expansion linéaire 4 fois des échantillons, des images multicolores de super-résolution (70 nm) peuvent être obtenues à l’aide d’un microscope confocal conventionnel ayant seulement une résolution de 300 nm et peuvent également être combinés avec d’autres techniques d’imagerie de super-résolution.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons le protocole ExPath16, une variante de proExM5 qui peut être appliquée aux types les plus communs d’échantillons de biopsie clinique utilisés en pathologie, y compris FFPE, H et E souillés, et des spécimens fraîchement congelés sur des lames de verre. La conversion de format, la récupération d’antigène, et l’immunostaining des spécimens suivent les protocoles couramment utilisés qui ne sont pas spécifiques à ExPath. Contrairement au prot…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le fonds de démarrage de la Faculté de l’Université Carnegie Mellon (YZ) et le prix du directeur des NIH New Innovator Award (DP2 OD025926-01 à YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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