Nanoskopische Bildgebung menschlicher Gewebeabschnitte über physikalische und isotrope Expansion
Summary
Nanoskalige Bildgebung klinischer Gewebeproben kann das Verständnis der Krankheitspathogenese verbessern. Expansionspathologie (ExPath) ist eine Version der Erweiterungsmikroskopie (ExM), modifiziert für die Kompatibilität mit Standard-Klinischen Gewebeproben, um die nanoskalige Konfiguration von Biomolekülen mit herkömmlichen Beugungsmikroskopen zu untersuchen.
Abstract
In der modernen Pathologie spielt die optische Mikroskopie eine wichtige Rolle bei der Krankheitsdiagnose, indem sie mikroskopische Strukturen klinischer Proben aufdeckt. Die grundlegende physikalische Beugungsgrenze verhindert jedoch das Verhören von nanoskaliger Anatomie und subtilen pathologischen Veränderungen bei verwendung herkömmlicher optischer Bildgebungsansätze. Hier beschreiben wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll, die sogenannte Expansionspathologie (ExPath), für die nanoskalige optische Bildgebung gängiger Arten klinischer Primärgewebeproben, einschließlich festgefrorener oder formalinfixierter Paraffingewebe (FFPE) Bereichen. Diese Methode umgeht die optische Beugungsgrenze, indem sie die Gewebeproben chemisch in Gewebe-Hydrogel-Hybride umwandelt und sie in reinem Wasser isisonsisch über mehrere Skalen ausdehnt. Durch die Ausdehnung werden bisher unlösbare Moleküle abgetrennt und können somit mit einem herkömmlichen optischen Mikroskop beobachtet werden.
Introduction
Die Untersuchung der molekularen Organisation von Geweben in einem dreidimensionalen (3D) Kontext kann ein neues Verständnis der biologischen Funktionen und der Krankheitsentwicklung liefern. Diese nanoskaligen Umgebungen liegen jedoch über den Auflösungsfähigkeiten herkömmlicher Beugungsmikroskope (200 bis 300 nm), wobei der minimale lösbare Abstand, d durch d <!–
–> –/NAdefiniert wird. Hier ist die Wellenlänge des Lichts und NA ist die numerische Blende (NA) des Bildgebungssystems. Kürzlich wurde die direkte Visualisierung fluoreszierend markierter Moleküle durch neu entwickelte hochauflösende Bildgebungstechniken1,2,3, einschließlich stimulierter Emissionserschöpfung (STED), ermöglicht. photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM), stochastische optische Rekonstruktionsmikroskopie (STORM) und strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM). Obwohl diese bildgebenden Verfahren das Verständnis der biologischen Funktion im Nanomaßstab revolutioniert haben, verlassen sie sich in der Praxis oft auf teure und/oder spezialisierte Geräte und Bildverarbeitungsschritte, können eine langsamere Erfassungszeit haben, verglichen mit konventionelle optische Bildgebung erfordern Fluorophore mit spezifischen Eigenschaften (z. B. Fotowechselfähigkeit und/oder hohe Photostabilität). Darüber hinaus bleibt es eine Herausforderung, 3D-Superauflösungs-Bildgebung an Gewebeproben durchzuführen.
Die Erweiterungsmikroskopie (ExM), die erstmals 2015 eingeführt wurde4, bietet eine alternative Möglichkeit, nanoskalige Merkmale (<70 nm) zu bildgeben, indem konservierte Proben, die in ein anschwellendes Polyelektrolythydrogel eingebettet sind, physisch erweitert werden. Hier bei einem Polymernetzwerk, das nach der chemischen Verarbeitung isotopisch erweitert werden kann, werden wichtige Biomoleküle und/oder Etiketten vor Ort verankert. Da die physikalische Ausdehnung die effektive Gesamtauflösung erhöht, können Moleküle von Interesse dann mit herkömmlichen Beugungs-begrenzten Bildgebungssystemen gelöst werden. Seit der Veröffentlichung des ursprünglichen Protokolls, bei dem kundenspezifische synthetisierte Fluoreszenzetiketten im Polymernetzwerk4verankert wurden, wurden neue Strategien zur direkten Verankerung von Proteinen (Proteinretention ExM oder proExM)verwendet 5, 6,7,8,9 und RNA9,10,11,12 zum Hydrogel, und erhöhen die physikalische Vergrößerung durch iterative Erweiterung13 oder Anpassung der Gelchemie8,14,15.
Hier stellen wir eine angepasste Version von proExM vor, die als Expansionpathologie (ExPath)16bezeichnet wird und für klinische Pathologieformate optimiert wurde. Das Protokoll wandelt klinische Proben, einschließlich formalinfixierter Paraffin-Embedded (FFPE), Hämatoxylin und Eosin (H&E) gebeizte und frisch gefrorene menschliche Gewebeproben, die auf Glasrutschen montiert sind, in einen mit ExM kompatiblen Zustand um. Proteine werden dann am Hydrogel verankert und die mechanische Homogenisierung durchgeführt (Abbildung 1)16. Mit einer 4-fachlinearen Ausdehnung der Proben können mehrfarbige Superauflösungsbilder (ca. 70 nm) mit einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop mit nur einer Auflösung von 300 nm erhalten und auch mit anderen hochauflösenden Bildgebungstechniken kombiniert werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier stellen wir das ExPath-Protokoll16vor, eine Variante von proExM5, die auf die häufigsten Arten von klinischen Biopsieproben angewendet werden kann, die in der Pathologie verwendet werden, einschließlich FFPE, H&E-Färbung und frisch gefroreneNproben auf Glasdias. Formatkonvertierung, Antigenabruf und Immunostainierung der Proben folgen häufig verwendeten Protokollen, die nicht exPath spezifisch sind. Im Gegensatz zum ursprünglichen proExM-Protokoll<sup class="xref"…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch den Faculty Start-up Fund der Carnegie Mellon University (YZ) und den NIH Director es New Innovator Award (DP2 OD025926-01 bis YZ) unterstützt.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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