शारीरिक और आइसोट्रोपिक विस्तार के माध्यम से मानव ऊतक धाराओं के Nanoscopic इमेजिंग
Summary
नैदानिक ऊतक नमूनों की नैनोस्केल इमेजिंग रोग रोगजनन की समझ में सुधार कर सकती है। विस्तार विकृति (ExPath) विस्तार माइक्रोस्कोपी का एक संस्करण है (ExM), मानक नैदानिक ऊतक के नमूने के साथ संगतता के लिए संशोधित, जैव अणुओं के नैनोस्केल विन्यास का पता लगाने के लिए पारंपरिक विवर्तन सीमित माइक्रोस्कोप का उपयोग कर.
Abstract
आधुनिक विकृति विज्ञान में, ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी नैदानिक नमूनों की सूक्ष्म संरचनाओं का खुलासा करके रोग निदान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, मौलिक भौतिक विवर्तन सीमा पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करते समय नैनोस्केल शरीर रचना विज्ञान और सूक्ष्म रोग परिवर्तन ों की पूछताछ को रोकता है। यहाँ, हम एक सरल और सस्ती प्रोटोकॉल का वर्णन, विस्तार विकृति (ExPath) कहा जाता है, नैदानिक प्राथमिक ऊतक नमूनों के आम प्रकार के नैनोस्केल ऑप्टिकल इमेजिंग के लिए, दोनों फिक्स्ड-फ्रोज़न या formalin-फिक्स्ड पैराफिन एम्बेडेड (FFPE) ऊतक सहित अनुभागों. इस विधि रासायनिक ऊतक-हाइड्रोगेल संकर में ऊतक के नमूने को बदलने और शारीरिक रूप से उन्हें शुद्ध पानी में कई तराजू भर में isotropically विस्तार द्वारा ऑप्टिकल विवर्तन सीमा को दरकिनार. विस्तार के कारण, पहले से अनसुलझे अणुओं को अलग कर रहे हैं और इस प्रकार एक पारंपरिक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर मनाया जा सकता है.
Introduction
एक तीन आयामी (3 डी) संदर्भ में ऊतकों के आणविक संगठन की जांच जैविक कार्यों और रोग के विकास की नई समझ प्रदान कर सकते हैं. तथापि, ये नैनोस्केल वातावरण पारंपरिक विवर्तन सीमित सूक्ष्मदर्शी (200$300 दउ) की संकल्प क्षमताओं से परे हैं, जहाँ न्यूनतम समाधान योग्य दूरी, घ को घ द्वारा परिभाषित किया जाता है <!–
–> । यहाँ र् प्रकाश की तरंगदैर्घ्य है तथा एएएन इमेजिंग प्रणाली का संख्यात्मक अपर्चर (एए) है। हाल ही में, फ्लोरोसेंट लेबल अणुओं के प्रत्यक्ष दृश्य नव विकसित सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक1,2,3, प्रेरित उत्सर्जन कमी (STED) सहित द्वारा संभव बनाया गया है, फोटो-सक्रिय स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (PALM), स्टोकास्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (STORM), और संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम)। हालांकि इन इमेजिंग तकनीक नैनोस्केल पर जैविक समारोह की समझ में क्रांति ला दी है, व्यवहार में, वे अक्सर महंगा और / पारंपरिक ऑप्टिकल इमेजिंग, विशिष्ट विशेषताओं के साथ फ्लोरोफोर्स की आवश्यकता होती है (जैसे फोटो-स्विचिंग क्षमता और / इसके अलावा, यह ऊतक नमूनों पर 3 डी सुपर संकल्प इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए एक चुनौती बनी हुई है।
विस्तार माइक्रोस्कोपी (ExM), पहली बार 20154में शुरू की, एक फूला हुआ polyelectrolyte hydrogel में एम्बेडेड संरक्षित नमूनों का शारीरिक विस्तार करके इमेजिंग नैनोस्केल सुविधाओं (और lt;70 एनएम) का एक वैकल्पिक साधन प्रदान करता है। यहाँ, कुंजी जैव अणुओं और / या लेबल एक बहुलक नेटवर्क है कि isotopically रासायनिक प्रसंस्करण के बाद विस्तार किया जा सकता है के लिए situ में लंगर डाले हैं. क्योंकि भौतिक विस्तार कुल प्रभावी संकल्प बढ़ जाती है, ब्याज के अणुओं तो पारंपरिक विवर्तन सीमित इमेजिंग सिस्टम का उपयोग कर हल किया जा सकता है. मूल प्रोटोकॉल के प्रकाशन के बाद से, जहां कस्टम संश्लेषित फ्लोरोसेंट लेबल बहुलक नेटवर्क4के लिए लंगर थे, नई रणनीतियों सीधे प्रोटीन लंगर करने के लिए इस्तेमाल किया गया है (प्रोटीन प्रतिधारण ExM, या proExM)5, 6,7,8,9 ,9 , आरएनए9,10,11,12 hydrogel के लिए , और पुनरावृत्त के माध्यम से शारीरिक आवर्धन में वृद्धि विस्तार13 या अनुकूलन जेल रसायन8,14,15.
यहाँ हम proExM के एक अनुकूलित संस्करण प्रस्तुत, विस्तार विकृति (ExPath)16कहा जाता है, जो नैदानिक विकृति प्रारूपों के लिए अनुकूलित किया गया है. प्रोटोकॉल नैदानिक नमूनों को परिवर्तित करता है, जिसमें फॉर्मलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड (एफएफपीई), हेमाटॉक्सिन और ईओसिन (एच एंड ई) दाग, और कांच की स्लाइडों पर लगाए गए ताजा जमे हुए मानव ऊतक नमूने, ExM के साथ संगत राज्य में शामिल हैं। इसके बाद प्रोटीनों को हाइड्रोजेल में लगाया जाता है और यांत्रिक समरूपीकरण किया जाता है (चित्र 1)16. नमूनों की एक 4 गुना रैखिक विस्तार के साथ, बहुरंगा सुपर संकल्प ($ 70 एनएम) छवियों केवल एक $ 300 एनएम संकल्प होने एक पारंपरिक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है और यह भी अन्य सुपर संकल्प इमेजिंग तकनीक के साथ जोड़ा जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ, हम ExPath प्रोटोकॉल16,proExM5 का एक संस्करण है कि FFPE, एच एंड ई दाग, और कांच स्लाइड पर ताजा जमे हुए नमूनों सहित पैथोलॉजी में इस्तेमाल नैदानिक बायोप्सी नमूनों का सबसे आम प्रकार के लिए लागू किय?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम कार्नेगी मेलॉन विश्वविद्यालय (वाईजेड) और NIH निदेशक की नई नवाचारी पुरस्कार (DP2 OD025926-01 से वाईजेड) से संकाय स्टार्ट-अप फंड द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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