물리적 및 등방성 확장을 통해 인간 조직 섹션의 나노 스코프 이미징
Summary
임상 조직 견본의 나노 규모 화상 진찰은 질병 병인의 이해를 향상할 수 있습니다. 확장 병리학 (ExPath)은 표준 임상 조직 샘플과의 호환성을 위해 변형 된 확장 현미경 검사법 (ExM)의 버전으로, 기존의 회절 제한된 현미경을 사용하여 생체 분자의 나노 스케일 구성을 탐구합니다.
Abstract
현대 병리학에서 광학 현미경 검사는 임상 표본의 현미경 구조를 밝혀 질병 진단에 중요한 역할을합니다. 그러나, 근본적인 물리적 회절 한계는 기존의 광학 화상 진찰 접근을 사용할 때 나노 규모 해부학 및 미묘한 병리학 적인 변경의 심문을 방지합니다. 여기에서, 우리는 임상 1 차 조직 견본의 일반적인 모형의 나노 규모 광학 화상 진찰을 위한 확장 병리에게 불린 간단하고 저렴한 프로토콜을 기술합니다, 둘 다 고정 된 동결 또는 포르말린 고정 파라핀 내장 (FFPE) 조직을 포함하 섹션. 이 방법은 조직 샘플을 화학적으로 조직 하이드로겔 하이브리드로 변환하고 순수한 물의 여러 비늘에서 등열대로 물리적으로 확장하여 광학 회절 한계를 우회합니다. 확장으로 인해 이전에는 해결할 수 없는 분자가 분리되어 기존의 광학 현미경을 사용하여 관찰할 수 있습니다.
Introduction
3차원(3D) 맥락에서 조직의 분자 조직을 조사하면 생물학적 기능과 질병 발달에 대한 새로운 이해를 제공할 수 있습니다. 그러나, 이러한 나노 스케일 환경은 최소 한용화 거리, dα/λ NA에 의해 정의되는 종래의 회절 제한 현미경(200−300 nm)의 분해 능을 넘어서는 <!–
–> 것이다. 여기서 λ는 빛의 파장이고 NA는 이미징 시스템의 수치 개구부(NA)이다. 최근에는 형광 표지된 분자의 직접 시각화가 새롭게 개발된 초고해상도 이미징 기술1,2,3,자극방출 고갈(STED)을 포함하여 가능해졌으며, 사진 활성화 국소화 현미경 검사법 (PALM), 연속 광학 재건 현미경 검사법 (STORM), 구조화 조명 현미경 검사법 (SIM). 이러한 이미징 기술은 나노 스케일에서 생물학적 기능에 대한 이해에 혁명을 일으켰지만 실제로는 고가의 및 /또는 특수 장비 및 이미지 처리 단계에 의존하는 경우가 많으며, 광 이미징과 같은 특정 특성을 가진 형광단이 필요합니다(예: 광 스위칭 기능 및/또는 높은 광 안정성). 또한, 조직 시편에서 3D 초고해상도 이미징을 수행하는 것은 여전히 과제입니다.
2015년4월에처음 도입된 확장 현미경 검사법(ExM)은 팽창성 폴리전해질 하이드로겔에 내장된 보존된 샘플을 물리적으로 확장하여 나노스케일 기능(&70 nm)을 이미징하는 대체 수단을 제공합니다. 여기서 주요 생체 분자 및/또는 라벨은 화학 처리 후 동위원소로 확장될 수 있는 폴리머 네트워크에 자리에 고정됩니다. 물리적 팽창은 총 유효 해상도를 증가하기 때문에, 관심 있는 분자는 기존의 회절 제한 이미징 시스템을 사용하여 해결될 수 있다. 사용자 정의 합성 형광 라벨이 폴리머 네트워크에 고정 된 원래 프로토콜의 출판 이후4,새로운 전략은 직접 단백질을 고정하는 데 사용되었습니다 (단백질 보존 ExM, 또는 proExM)5, 6,7,8,9 및 RNA9, 10,11,12를 하이드로겔로, 반복을 통해 물리적 배율을 증가시다. 확장13 또는 적응 젤 화학8,14,15.
여기에서 우리는 임상 병리학 형식에 최적화된 확장 병리학 (ExPath)16에게불린 proExM의 적응된 버전을 제시합니다. 이 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE), 헤마톡신 및 에오신(H&E) 스테인드, 유리 슬라이드에 장착된 신선 냉동 인간 조직 표본을 포함한 임상 샘플을 ExM과 호환되는 상태로 변환합니다. 단백질은 하이드로겔에 고정되고 기계적 균질화가 수행된다(도1)16. 시료의 4배 선형 팽창을 통해~ ~300 nm 해상도만을 갖는 기존의 공초점 현미경을 사용하여 다중 컬러 초고해상도(~70nm) 이미지를 얻을 수 있으며 다른 초고해상도 이미징 기술과도 결합될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에서는 FFPE, H&E 스테인드 및 유리 슬라이드에 새로 얼어붙은 시편을 포함하여 병리학에 사용되는 가장 일반적인 유형의 임상 생검 샘플에 적용할 수 있는 proExM5의 변형인 ExPath 프로토콜16을제시합니다. 견본의 포맷 변환, 항원 회수 및 면역 염색은 ExPath에 특이적이지 않은 일반적으로 사용되는 프로토콜을 따릅니다. 원래 proExM 프로토콜9와…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 카네기 멜론 대학에서 학부 창업 기금에 의해 지원되었다 (YZ) 및 NIH 이사의 새로운 혁신 상 (DP2 OD025926-01 YZ에).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
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