Nanoscopic Imaging av Human tissue seksjoner via fysisk og isotropic ekspansjon
Summary
Nanoskala avbildning av kliniske vevsprøver kan forbedre forståelsen av sykdoms patogenesen. Ekspansjon patologi (ExPath) er en versjon av ekspansjon mikroskopi (ExM), modifisert for kompatibilitet med standard kliniske vevsprøver, for å utforske nanoskala konfigurasjonen av biomolekyler bruker konvensjonelle Diffraksjon begrenset mikroskop.
Abstract
I moderne patologi spiller optiske mikroskopi en viktig rolle i sykdoms diagnosen ved å avsløre mikroskopiske strukturer av kliniske prøver. Men den grunnleggende fysiske Diffraksjon grensen hindrer avhør av nanoskala anatomi og subtile patologiske forandringer ved bruk av konvensjonelle optiske Imaging tilnærminger. Her beskriver vi en enkel og rimelig protokoll, kalt Utvidelses patologi (ExPath), for nanoskala optisk avbildning av vanlige typer kliniske prøver av primær vev, inkludert både fast frosset eller formalin-fast parafin innebygd (FFPE) vev Deler. Denne metoden omgår den optiske Diffraksjon grensen ved kjemisk transformere vevsprøvene i vev-hydrogel hybrid og fysisk utvide dem isotropically over flere skalaer i rent vann. På grunn av ekspansjon, er tidligere uløselig molekyler separert og kan dermed observeres ved hjelp av en konvensjonell optisk mikroskop.
Introduction
Gransker molekylær organisering av vev i en tredimensjonal (3D) kontekst kan gi ny forståelse av biologiske funksjoner og sykdomsutvikling. Disse nanoskala miljøene er imidlertid utenfor oppløsnings egenskapene til konvensjonelle Diffraksjon begrenset mikroskop (200 − 300 NM), der minimal kan løses avstand, d er definert av d α <!–
–> λ/na. Her λ er Bølgelengden av lys og na er den numeriske blenderåpning (na) av Imaging system. Nylig har direkte visualisering av fluorescensmerkete merket molekyler blitt gjort mulig av nyutviklet super-oppløsning Imaging teknikker1,2,3, inkludert stimulert utslipp tømming (sted), Foto-aktivert lokalisering mikroskopi (PALM), Stokastisk optisk rekonstruksjon mikroskopi (STORM), og strukturert belysning mikroskopi (SIM). Selv om disse Imaging teknikkene har revolusjonert forståelsen av biologisk funksjon på nanoskala, i praksis, de ofte stole på dyre og/eller spesialisert utstyr og bildebehandling trinn, kan ha tregere oppkjøpet tid å sammenligne med vanlig optisk tenkelig, forlange fluorophores med spesifikk kjennetegnene (som Foto-skifter evnen og/eller høy photostability). I tillegg er det fortsatt en utfordring å utføre 3D super oppløselig bilde på vevsprøver.
Expansion mikroskopi (ExM), først introdusert i 20154, gir en alternativ måte å Imaging nanoskala funksjoner (< 70 NM) ved å fysisk utvide bevarte prøver innebygd i en swellable polyelectrolyte hydrogel. Her er nøkkel biomolekyler og/eller etiketter forankret i situ til et polymer nettverk som kan isotopically utvides etter kjemisk behandling. Fordi den fysiske utvidelsen øker den totale effektive oppløsningen, kan molekyler av interesse deretter løses ved hjelp av konvensjonelle Diffraksjon bilde systemer. Siden utgivelsen av den opprinnelige protokollen, der tilpassede syntetisert fluorescerende etiketter ble forankret til polymer nett4, har nye strategier blitt brukt til direkte anker proteiner (protein oppbevaring ExM, eller proExM)5, 6,7,8,9 og RNA9,10,11,12 til hydrogel, og Øk fysisk forstørrelse gjennom gjentakende ekspansjon13 eller tilpasse gel kjemi8,14,15.
Her presenterer vi en tilpasset versjon av proExM, kalt utvidelse patologi (ExPath)16, som har blitt optimalisert for klinisk patologi formater. Protokollen omdanner klinisk prøvene, inkluderer formalin-bestemt parafin-lagt ned i (FFPE), hematoksylin og eosin (H & E) flekkete, og frisk-frosset Human tissue prøver montert opp på barometer lysbilder, i en begrunne forenlig med ExM. Proteiner blir deretter forankret til hydrogel og mekanisk homogenisering utføres (figur 1)16. Med en 4-fold Lineær utvidelse av prøvene, flerfarget super-oppløsning (~ 70 NM) bilder kan fås ved hjelp av en konvensjonell konfokalmikroskopi mikroskop har bare en ~ 300 NM oppløsning og kan også kombineres med andre super-oppløsning Imaging teknikker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her presenterer vi ExPath protokoll16, en variant av proExM5 som kan brukes på de vanligste typene klinisk biopsi prøvene brukes i patologi, inkludert FFPE, H & E beiset, og fersk-frosne eksemplarer på glass lysbilder. Format konvertering, antigen gjenfinning, og immunostaining av prøvene følger ofte brukte protokoller som ikke er spesifikke for ExPath. I motsetning til den opprinnelige proExM protokollen9, ExPath avhengig av en høyere konsentr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av fakultetet oppstart fondet fra Carnegie Mellon University (YZ) og NIH Director ‘ s New innovatør Award (DP2 OD025926-01 til YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
