Nanoskopisk avbildning av mänskliga vävnads sektioner via fysisk och isotropisk expansion
Summary
Nanoskalig avbildning av kliniska vävnadsprover kan förbättra förståelsen av sjukdomens patogenes. Expansion patologi är en version av expansionsmikroskopi (ExM), modifierad för kompatibilitet med vanliga kliniska vävnadsprover, för att utforska nanoskalens konfiguration av biomolekyler med konventionella diffraktions begränsade Mikroskop.
Abstract
I modern patologi spelar optisk mikroskopi en viktig roll vid sjukdomsdiagnos genom att avslöja mikroskopiska strukturer av kliniska prover. Men den grundläggande fysiska diffraktionsgränsen förhindrar förhör av nanoskala anatomi och subtila patologiska förändringar när man använder konventionella optiska Imaging metoder. Här beskriver vi ett enkelt och billigt protokoll, kallad expansion patologi (ExPath), för nanoskala optisk avbildning av vanliga typer av kliniska primär vävnad prover, inklusive både fast frysta eller formalin-fast paraffin inbäddade (FFPE) vävnad Sektioner. Denna metod kringtar den optiska diffraktionsgränsen genom att kemiskt omvandla vävnadsproverna till vävnad-hydrogel hybrid och fysiskt utvidga dem isotropically över flera skalor i rent vatten. På grund av expansion separeras tidigare oresolvable molekyler och kan därför observeras med hjälp av ett konventionellt optiskt mikroskop.
Introduction
Undersöka den molekylära organisationen av vävnader i en tredimensionell (3D) sammanhang kan ge ny förståelse för biologiska funktioner och sjukdomsutveckling. Dessa nanoskaliga miljöer ligger dock bortom upplösningen hos konventionella diffraktions begränsade Mikroskop (200 − 300 nm), där det minimala matchbara avståndet, d definieras av d α <!–
–> λ/na. Här är λ våglängden av ljus och na är den numeriska bländare (na) i bildsystemet. Nyligen har direkt visualisering av fluorescerande märkta molekyler möjliggjorts genom nyutvecklade super-resolution Imaging tekniker1,2,3, inklusive stimulerad emission utarmning (sted), fotoaktive rad lokaliseringsmikroskopi (PALM), stokastisk optisk rekonstruktion, mikroskopi (STORM) och strukturerad belysningsmikroskopi (SIM). Även om dessa avbildningstekniker har revolutionerat förståelsen av biologisk funktion i nanoskalan, i praktiken förlitar de sig ofta på dyr och/eller specialiserad utrustning och bildbehandlings steg, kan ha långsammare förvärvs tid jämfört med konventionell optisk avbildning, kräver fluoroforer med specifika egenskaper (t. ex. foto växlings förmåga och/eller hög foto stabilitet). Dessutom är det fortfarande en utmaning att utföra 3D super-upplösning Imaging på vävnadsprover.
Expansion mikroskopi (EXM), som först infördes i 20154, ger ett alternativt sätt att Imaging nanoskala funktioner (< 70 nm) genom att fysiskt utvidga bevarade prover inbäddade i en väll polyelektrolyt hydrogel. Här är viktiga biomolekyler och/eller etiketter förankrade på plats till ett polymernät som kan utökas isotopiskt efter kemisk bearbetning. Eftersom den fysiska expansionen ökar den totala effektiva upplösningen kan molekyler av intresse sedan lösas med konventionella diffraktions-begränsade avbildningssystem. Sedan offentliggörandet av det ursprungliga protokollet, där anpassade syntetiserade fluorescerande etiketter var förankrade till polymer Network4, nya strategier har använts för att direkt förankra proteiner (protein retention EXM, eller proExM)5, 6,7,8,9 och RNA9,10,11,12 till Hydrogelen och öka den fysiska förstoringen genom iterativ expansion13 eller anpassning av gel kemin8,14,15.
Här presenterar vi en anpassad version av proExM, kallad expansion patologi (ExPath)16, som har optimerats för kliniska patologi format. Protokollet omvandlar kliniska prover, inklusive formalin-fast paraffin-inbäddade (FFPE), hematoxylin och eosin (H & E) färgade, och färskt frysta mänskliga vävnadsprover monterade på glas diabilder, i en stat som är kompatibel med ExM. Proteiner är sedan förankrade till hydrogel och mekanisk homogenisering utförs (figur 1)16. Med en 4-faldig linjär expansion av proverna, Multicolor super-resolution (~ 70 nm) bilder kan erhållas med hjälp av en konventionell konfokal Mikroskop med endast en ~ 300 nm upplösning och kan också kombineras med andra super-upplösning Imaging tekniker.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här presenterar vi ExPath protokoll16, en variant av proExM5 som kan appliceras på de vanligaste typerna av kliniska biopsi prover som används i patologi, inklusive ffpe, H & E färgade, och färska frysta exemplar på glas diabilder. Format konvertering, antigen hämtning och immunofärgning av proverna följer vanliga protokoll som inte är specifika för ExPath. Till skillnad från den ursprungliga proExM protokoll9, expath förlitar sig på en…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av fakultetens start fond från Carnegie Mellon University (YZ) och NIH Director ‘ s New Innovator Award (DP2 OD025926-01 till YZ).
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
