Fiziksel ve İzotropik Genişleme Yoluyla İnsan Doku Bölümlerinin Nanoskobik Görüntülemesi
Summary
Klinik doku örneklerinin nanoölçekli görüntülemesi hastalık patogenezinin anlaşılmasını iyileştirebilir. Genleşme patolojisi (ExPath), geleneksel kırınım sınırlı mikroskoplar kullanarak biyomoleküllerin nano ölçekli konfigürasyonunun araştırılması için standart klinik doku örnekleriile uyumluluk için modifiye edilen genleşme mikroskobunun (ExM) bir versiyonudur.
Abstract
Modern patolojide optik mikroskopi, klinik örneklerin mikroskobik yapılarını ortaya çıkararak hastalık tanısında önemli bir rol oynamaktadır. Ancak, temel fiziksel kırınım sınırı geleneksel optik görüntüleme yaklaşımları kullanırken nanoölçekli anatomi ve ince patolojik değişikliklerin sorgulanmasını önler. Burada, hem sabit dondurulmuş hem de formalin-sabit parafin gömülü (FFPE) doku dahil olmak üzere klinik primer doku örneklerinin ortak tiplerinin nano ölçekli optik görüntülemesi için genişleme patolojisi (ExPath) adı verilen basit ve ucuz bir protokolü tanımlıyoruz. Bölüm. Bu yöntem, doku örneklerini kimyasal olarak doku-hidrojel melezine dönüştürerek ve fiziksel olarak saf suda birden fazla pulda izole ederek optik kırınım sınırını aşar. Genişleme nedeniyle, daha önce çözülemeyen moleküller ayrılır ve böylece geleneksel optik mikroskop kullanılarak gözlemlenebilir.
Introduction
Dokuların moleküler organizasyonunun üç boyutlu (3D) bir bağlamda araştırılması, biyolojik fonksiyonlar ve hastalık gelişimi hakkında yeni bir anlayış sağlayabilir. Ancak, bu nano ölçekli ortamlar, en az çözülebilir uzaklığın d α λ / NA ile tanımlandığı konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskopların (200−300 nm) çözünürlük yeteneklerinin <!–
–> ötesindedir. Burada λ ışığın dalga boyu ve NA görüntüleme sisteminin sayısal diyafram (NA) olduğunu. Son zamanlarda, floresan etiketli moleküllerin doğrudan görselleştirme mümkün yeni geliştirilen süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri1,2,3, uyarılmış emisyon tükenmesi de dahil olmak üzere (STED), foto-aktive lokalizasyon mikroskobu (PALM), stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopisi (STORM) ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM). Bu görüntüleme teknikleri nano ölçekte biyolojik fonksiyon anlayışında devrim yarattı, ancak pratikte, genellikle pahalı ve/veya özel ekipman ve görüntü işleme adımlarına güvenirler, geleneksel optik görüntüleme, belirli özelliklere sahip floroforlar gerektirir (fotoğraf anahtarlama yeteneği ve/veya yüksek fotostabilite gibi). Buna ek olarak, doku örnekleri üzerinde 3D süper çözünürlüklü görüntüleme gerçekleştirmek için bir meydan okuma olmaya devam etmektedir.
İlk olarak 20154yılında tanıtılan genleşme mikroskobu (ExM), şişme polielektrolit hidrojeline gömülü korunmuş numuneleri fiziksel olarak genişleterek nano ölçekli özellikleri (<70 nm) görüntülemede alternatif bir araç sağlar. Burada, anahtar biyomoleküller ve/veya etiketler, kimyasal işleme den sonra izotonik olarak genişletilebilen bir polimer ağa yerinde sabitlenir. Fiziksel genişleme toplam etkin çözünürlüğü arttırdığından, ilgi molekülleri geleneksel kırınım sınırlı görüntüleme sistemleri kullanılarak çözülebilir. Özel sentezlenmiş floresan etiketlerin polimer ağına bağlı olduğu orijinal protokolün yayınlanmasından bu yana4, proteinleri (protein tutma ExM veya proExM) doğrudan bağlamak için yeni stratejiler kullanılmıştır5, 6,7,8,9 ve RNA9,10,11,12 hidrojel için, ve yineleme ile fiziksel büyütme artırmak genişleme13 veya adapte jelkimyası 8,14,15.
Burada proExM’in genleşme patolojisi (ExPath)16olarak adlandırılan ve klinik patoloji biçimleri için optimize edilmiş uyarlanmış bir versiyonunu salıyoruz. Protokol, formalin-sabit parafin gömülü (FFPE), hemaoksilin ve eozin (H&E) lekeli ve cam slaytlara monte edilmiş taze dondurulmuş insan doku örnekleri dahil olmak üzere klinik örnekleri ExM ile uyumlu bir duruma dönüştürür. Proteinler daha sonra hidrojele sabitlenir ve mekanik homojenizasyon yapılır (Şekil 1)16. Numunelerin 4 kat lineer genişlemesi ile çok renkli süper çözünürlükte (~70 nm) görüntüler, sadece ~300 nm çözünürlüğe sahip geleneksel konfokal mikroskop kullanılarak elde edilebilir ve diğer süper çözünürlüklü görüntüleme teknikleri ile de kombine edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, ffpe, H&E vitray ve cam slaytlar üzerinde taze dondurulmuş numuneler de dahil olmak üzere patolojide kullanılan klinik biyopsi örneklerinin en yaygın türlerine uygulanabilen proExM5’in bir varyantı olan ExPathprotokol16’yısıyoruz. Biçim dönüştürme, antijen alımı ve örneklerin immünboyamı ExPath’e özgü olmayan yaygın olarak kullanılan protokolleri izler. Orijinal proExM protokolü aksine9, ExPath sindirim tampon EDTA da…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Carnegie Mellon Üniversitesi (YZ) ve NIH Direktörü’nün Yeni Yenilikçi Ödülü (DP2 OD025926-01’den YZ’ye) Fakülte Başlangıç fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| 4-hydroxy-TEMPO (4HT) | Sigma Aldrich | 176141 | Inhibitor |
| 6-well glass-bottom plate (#1.5 coverglass) | Cellvis | P06-1.5H-N | |
| Acetone | Fischer Scientifc | A18-500 | |
| Acrylamide | Sigma Aldrich | A8887 | |
| Acryloyl-X, SE (AcX) | Invitrogen | A20770 | |
| Agarose | Fischer Scientifc | BP160-100 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Sigma Aldrich | A3678 | Initiatior |
| Anti-ACTN4 antibody produced in rabbit | Sigma Aldrich | HPA001873 | |
| Anti-Collagen IV antibody produced in mouse | Santa Cruz Biotech | sc-59814 | |
| Anti-Vimentin antibody produced in chicken | Abcam | ab24525 | |
| Aqua Hold II hydrophobic pen | Scientific Device | 980402 | |
| Breast Common Disease Tissue Array | Abcam | ab178113 | |
| DAPI (1 mg/mL) | Thermo Scientific | 62248 | Nuclear stain |
| Diamond knife No. 88 CM | General Tools | 31116 | |
| Ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 0.5 M |
VWR | BDH7830-1 | |
| FFPE Kidney Sample | USBiomax | HuFPT072 | |
| Forceps | |||
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF488A | Biotium | 20020 | |
| Goat Anti-Chicken IgY (H+L), Highly Cross-Adsorbed CF633 | Biotium | 20121 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Alexa Fluor 546 | Invitrogen | A11010 | |
| MAXbind Staining Medium | Active Motif | 15253 | Can be substituted with non-commercial staning buffer of choice. |
| MAXblock Blocking Medium | Active Motif | 15252 | Can be substituted with non-commercial blocking buffer of choice. |
| MAXwash Washing Medium | Active Motif | 15254 | Can be substituted with non-commercial washing buffer of choice. |
| Micro cover Glass #1 (24x60mm) | VWR | 48393 106 | |
| Micro cover Glass #1.5 (24x60mm) | VWR | 48393 251 | |
| N,N,N′,N′- Tetramethylethylenediamine (TEMED) |
Sigma Aldrich | T9281 | Accelerator |
| N,N′-Methylenebisacrylamide | Sigma Aldrich | M7279 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | For preparing blocking buffer. Dependent on animal host of secondary antibodies. |
| Nunclon 4-Well x 5 mL MultiDish Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 167063 | Multi-well plastic culture dish |
| Nunclon 6-Well Cell Culture Dish | Thermo Fisher | 140675 | |
| Nunc 15mL Conical | Thermo Fisher | 339651 | |
| Nunc 50mL Conical | Thermo Fisher | 339653 | |
| Orbital Shaker | |||
| Paint brush | |||
| pH Meter | |||
| Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x Solution | Fischer Scientifc | BP399-1 | |
| Plastic Petri Dish (100 mm) | Fischer Scientifc | FB0875713 | |
| Proteinase K (Molecular Biology Grade) | Thermo Scientific | EO0491 | |
| Razor blade | Fischer Scientifc | 12640 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 1.5 mL | Thermo Fisher | 3457 | |
| Safelock Microcentrifuge Tubes 2.0 mL | Thermo Fisher | 3459 | |
| Sodium acrylate | Sigma Aldrich | 408220 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S6191 | |
| Sodium citrate tribasic dihydrate | Sigma Aldrich | C8532-1KG | |
| Tris Base | Fischer Scientifc | BP152-1 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Wheat germ agglutinin labeled with CF640R | Biotium | 29026 | |
| Xylenes | Sigma Aldrich | 214736 |
References
- Hell, S. W. Far-Field Optical Nanoscopy. Science. 316 (5828), 1153-1158 (2007).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79 (1), 2.1.1-2.1.25 (2017).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. Journal of Cell Biology. 190 (2), 165-175 (2010).
- Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
- Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nature Biotechnology. 34, 987-992 (2016).
- Chozinski, T. J., et al. Expansion microscopy with conventional antibodies and fluorescent proteins. Nature Methods. 13 (6), 485-488 (2016).
- Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nature Biotechnology. 34 (9), 973-981 (2016).
- Truckenbrodt, S., Maidorn, M., Crzan, D., Wildhagen, H., Kabatas, S., Rizzoli, S. O. X10 expansion microscopy enables 25-nm resolution on conventional microscopes. EMBO Reports. 19 (9), e45836 (2018).
- Asano, S. M., et al. Expansion Microscopy: Protocols for Imaging Proteins and RNA in Cells and Tissues. Current Protocols in Cell Biology. 80 (1), 1-41 (2018).
- Chen, F., et al. Nanoscale imaging of RNA with expansion microscopy. Nature Methods. 13 (8), 679-684 (2016).
- Tsanov, N., et al. SmiFISH and FISH-quant – A flexible single RNA detection approach with super-resolution capability. Nucleic Acids Research. 44 (22), e165 (2016).
- Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy. Scientific Reports. 8 (1), 1-13 (2018).
- Chang, J. B., et al. Iterative expansion microscopy. Nature Methods. 14 (6), 593-599 (2017).
- Cipriano, B. H., et al. Superabsorbent hydrogels that are robust and highly stretchable. Macromolecules. 47 (13), 4445-4452 (2014).
- Truckenbrodt, S., Sommer, C., Rizzoli, S. O., Danzl, J. G. A practical guide to optimization in X10 expansion microscopy. Nature Protocols. 14 (3), 832-863 (2019).
- Zhao, Y., et al. Nanoscale imaging of clinical specimens using pathology-optimized expansion microscopy. Nature Biotechnology. 35 (8), 757-764 (2017).
