Vi presenterar metoden för isolering av murina myocyter och hur man får spänning eller kalcium spår samtidigt med sarcomere förkorta spår med fluorescensfotometri med samtidig Digital cell geometri mätningar.
Förmågan att isolera vuxna hjärt myocyter har tillåtit forskare att studera en mängd olika hjärtsjukdomar på singelcellsnivå. Även om framstegen i kalcium känsliga färgämnen har tillåtit en robust optisk inspelning av Single cell kalciumdynamik, har inspelningen av robusta transmembranoptiska spänningssignaler varit svår. Förmodligen är detta på grund av den låga enkel-brus-förhållande, fototoxicitet, och photoblekning av traditionella potentiometriska färgämnen. Därför har enstaka cell spänningsmätningar länge varit begränsade till plåstret klämma teknik som medan Guldstandarden, är tekniskt krävande och låg genomströmning. Men med utvecklingen av nya potentiometriska färgämnen, stora, snabba optiska svar på förändringar i spänning kan erhållas med liten eller ingen fototoxicitet och photoblekning. Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar vuxna murina myocyter som kan användas för cellulära förkortning, kalcium, och optisk spänning mätningar. Specifikt, protokollet beskriver hur man använder en ratiometriska kalcium färgämne, en enda excitation kalcium färgämne, och en enda excitation spänning färgämne. Denna metod kan användas för att bedöma kardiotoxicitet och arytmogenicitet av olika kemiska ämnen. Medan fototoxicitet är fortfarande ett problem på den enda cellnivå, är metodik diskuteras om hur man minskar den.
För att studera hjärtat under friska och patologiska tillstånd, det är ofta bra att undersöka fenotyp på enda cellnivå. Även om vetenskapliga framsteg har tillåtit robust mätning av Single cell kalciumdynamik, Single cell optisk spänning mätningar har varit knappa1. Förmodligen är detta på grund av låg signal-brus-förhållande (SNR), fototoxicitet, och photoblekning av traditionella potentiometriska färgämnen2,3. Icke desto mindre, isolerade myocyt optiska åtgärder potentialer har erhållits2,3,4. Vidare, med framsteg inom kemin och fysiken i spänningskänsliga färgämnen, har SNR förbättrats5. Nyare membran potentiella sonder (tabell över material) reagera på förändringar i membranet potential i sub-millisekunder och har en fluorogena responsintervall på cirka 25% per 100 MV. Ytterligare, excitation/emission av membranet potentiella Kit (t. ex., FluoVolt; Tabell över material) används i detta protokoll fungerar med standard fluorescein isotiocyanat (FITC) eller grönt fluorescerande protein (GFP) inställningar6.
FITC och GFP excitation/emission Spectra överlappar fluo-4 kalcium bundet Spectra7. Samtidig anskaffning av fluorescensfotometri med mätningar av digital cell geometri har traditionellt använts för samtidig anskaffning av kalcium-och cellulära förkortningsmätningar8. Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar murina myocyter och hur man spelar in kalcium eller spänningssignaler med hjälp av standard FITC inställningar. Dessutom beskriver det hur en enkel switch i excitation/utsläpp filter på Imaging Workstation kan användas för att få kalcium och förkorta mätningar med hjälp av förhållandet metriska kalcium färgämne fura-2. Jämfört med fluo-4 har fura-2 en högre affinitet för kalcium och är relativt motståndskraftig mot foto blekning9. Därför, med hjälp av en enda arbetsstation detta protokoll möjliggör en grundlig undersökning av enstaka myocyt excitation-kontraktion koppling.
Att kunna isolera hjärt myocyter är en kraftfull metod som kan användas för att förstå hjärtfysiologi, patologi, och toxikologi. I ovanstående protokoll, vi beskrev en metod som utnyttjar en konstant gravitation tryck Langendorff apparat för att få enda hjärt myocyter. Efteråt, med hjälp av fluorescensfotometri systemet, beskriver vi hur man samtidigt förvärvar antingen kalcium och förkortning eller spänning och förkorta spår.
På grund av den olika kinetik mellan kalcium färgämnen, måste försiktighet iakttas på vilken färg att välja. För detta protokoll, både fura-2 och fluo-4 som används var konstruerade med AM estrar som kräver ett tvättsteg för att möjliggöra intracellulära esteraser tid att klyva AM-gruppen och fälla färgen i cellen. Medan både fura-2 och fluo-4 anses vara hög affinitet kalcium färgämnen, är KD för fura-2 145 nM jämfört med 345 nM för fluo-49. Vidare är fura-2 ratiometriskt. På grund av detta, det kan användas för att kvantifiera intracellulära kalciumnivåer9,12. Fluo-4 å andra sidan är en enda våg kalcium sond. Fördelen med att använda fluo-4 är att den ger en ljusare fluorescens-signal. Oavsett vilket kalcium färgämne används, jämfört med kalcium färgämnet, membran spänning sonder har en lägre SNR.
Som framgår av figur 4 och figur 5, är spännings spår jämfört med kalcium spår mindre i amplitud. Med hjälp av programvarans digitala spår filtrering, är det möjligt att öka SNR och kvantifiera data (figur 4 och figur 7). En gång kvantifierat, både kalcium transienter och optiska APDs Visa restitution, förkorta deras varaktighet vid snabbare pacing frekvenser (figur 2, figur 3, figur 6, och figur 7). Kortare APDs under snabbare pacing cykler är nödvändiga för att ge tillräckligt med tid för ventrikulär fyllning under diastole. Förändringar i detta fenomen tros vara ett tecken på en ökning av risken för arytmier13,14,15,16. Medan förändringar i APD kan orsakas av sjukdom, de kan också orsakas av kemikalier. Som visas i figur 7, när den dominerande murina repolariserande kalium ström, itill, blockeras, den optiska APD blir längre.
Fortfarande, som rapporterats tidigare med spänningskänsliga färgämnen, ljusstyrka och varaktighet kan förändra APD2,5,17. Detta tros vara resultatet av generering av reaktiva oxidativa arter (ROS)5. Tidigare har det visats att tillsats av antioxidanter till inspelnings lösningen kan förhindra spänningskänsliga Dye cytotoxicitet5. Som ett resultat, vi lagt till antioxidanten L-Glutathione (10 mM), till Tyrodes lösning. Visas i figur 8 är de sista 11 s av en 20 s inspelning erhålls vid 1 Hz pacing. Som indikeras av de röda pilarna, förändringar i APD inträffade inte förrän 15 s i inspelningen; Därför, medan den modifierade Tyrodes lösning inte hindrade fototoxicitet det fördröjde det signifikant. Med hjälp av modifierad Tyrodes lösning, med en låg ljusintensitet inställning och hålla varaktigheten av inspelningen till under 5 s, är det möjligt att undvika eventuella Dye inducerade förändringar i APD. Detta är viktigt eftersom utan att vara noga med att undvika fototoxicitet, data kan misstolkas som orsakar tidig eller fördröjd efter depolarizations. Förutom att begränsa exponeringen för blått ljus, finns det ytterligare försiktighetsåtgärder som kan vidtas för att förhindra feltolkning av data.
Den första är att endast spela in från celler som följer en till en pacing och har en vilande sarcomere längd större än eller lika med 1,75 μm. Den 1,75 μm cutoff tas från observation av Gordon et al.18 att spänningen snabbt avtar när sarcomere längd är under detta belopp. Icke desto mindre, vissa patologier kan resultera i betydande förändringar i vilande sarcomere längd. För att vara säker på att fenotypen är verklig och inte en artefakt av isoleringen, bör följande problem tagnings metoder tas.
Om myocyter är genomgående inte följer 1:1 pacing, har sarcomere längder under 1,75 μm, tungt membran blebbing, eller inte överlever isoleringen, det första att kontrollera är den tid det tog att kannulate hjärtat. Ju längre kanylering tid, desto lägre avkastningen blir. Om en lång kanylering tid krävs, kan lönsamheten förbättras genom att placera hjärtat i en cardioplegic lösning19. Icke desto mindre, eftersom kollagenase är ett enzym, aktivitet och specificitet av ett visst parti förändras över tiden. Om den totala avkastningen successivt förvärras trots god kanylering gånger, nya partier bör analyseras. Medan vårt protokoll var optimerat för 5 s inspelningar, om längre spännings spår behövs, kommer ytterligare neutrala täthetsfilter att behöva köpas. Systemet som beskrivs i protokollet levereras med neutrala täthetsfilter som minskar det överförda ljuset med 37%, 50%, 75%, 90% och 95%.
Sammanfattnings, beskrev vi en metod som tillät isolering av vuxna murina ventrikulära myocyter som användes för kalcium, spänning, och sarcomere förkorta mätningar.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dana Morgenstern för noggrann korrekturläsning av manuskriptet.
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |