Vi præsenterer metoden til isolering af murine myocytter og hvordan man får spænding eller calcium spor samtidig med sarcomere afkortning af spor ved hjælp af fluorescens fotometri med samtidige digitale celle geometri målinger.
Evnen til at isolere voksne hjerte myocytter har tilladt forskerne at studere en række kardielle patologier på enkelt celleniveau. Mens fremskridt i calcium følsomme farvestoffer har tilladt den robuste optiske optagelse af enkelt celle calcium dynamik, registrering af robuste transmembran optiske spændings signaler har været vanskeligt. Velsagtens, dette er på grund af den lave single-to-støj ratio, fototoksicitet, og foto blegning af traditionelle potentiometriske farvestoffer. Derfor har enkelt celle spændings målinger længe været begrænset til patch clamp teknik, som mens guldstandarden, er teknisk krævende og lav gennemløb. Men med udviklingen af nye potentiometriske farvestoffer, store, hurtige optiske reaktioner på ændringer i spænding kan opnås med lidt at ingen fototoksicitet og foto blegning. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan man isolerer voksne murine myocytter, som kan bruges til cellulære forkortelse, calcium, og optisk spænding målinger. Specifikt, protokollen beskriver, hvordan man bruger en ratiometrisk calcium farvestof, en enkelt-excitation calcium farvestof, og en enkelt excitation spændings farvestof. Denne fremgangsmåde kan anvendes til at vurdere kardiotoksicitet og arytmogenicitet af forskellige kemiske agenser. Selv om fototoksicitet stadig er et problem på enkelt celleniveau, diskuteres metoden om, hvordan den skal reduceres.
For at studere hjertet under sunde og patologiske tilstande, er det ofte nyttigt at undersøge fænotype på enkelt celleniveau. Mens videnskabelige fremskridt har tilladt den robuste måling af enkelt celle calcium dynamik, enkelt celle optisk spænding målinger er forblevet knappe1. Formentlig, dette er på grund af den lave signal til støj ratio (SNR), fototoksicitet, og foto blegning af traditionelle potentiometriske farvestoffer2,3. Ikke desto mindre, isolerede nekrotiske optiske handlings potentialer er opnået2,3,4. Yderligere, med fremskridt i kemi og fysik af spændings følsomme farvestoffer, SNR har forbedret5. Nyere membran potentielle sonder (tabel over materialer) reagerer på ændringer i membranpotentialet i sub-millisekunder og har et fluorogent respons område på ca. 25% pr. 100 mv. Yderligere, excitation/emission af membran potentielle Kit (f. eks, FluoVolt; Tabel over materialer) anvendes i denne protokol virker med standard fluorescein isothiocyanat (FITC) eller grøn fluorescerende protein (GFP) indstillinger6.
Den FITC og GFP excitation/emission spektre overlapper med fluo-4 calcium bundet Spectra7. Samtidig erhvervelse af fluorescens fotometri med digitale celle geometri målinger traditionelt er blevet anvendt til samtidig erhvervelse af calcium og cellulære afkortning målinger8. Denne protokol beskriver i detaljer, hvordan man isolerer murine myocytter, og hvordan man registrerer calcium-eller spændings signaler ved hjælp af standard FITC-indstillinger. Derudover beskriver den, hvordan en simpel switch i excitation/emission filtre på Imaging arbejdsstation kan bruges til at opnå calcium og afkortning målinger ved hjælp af forholdet metriske calcium farvestof Fura-2. Sammenlignet med fluo-4 har Fura-2 en højere affinitet for calcium og er relativt modstandsdygtig over for foto blegning9. Derfor, ved hjælp af en enkelt arbejdsstation denne protokol giver mulighed for en grundig undersøgelse af enkeltvis nekrotiske excitation-sammentrækning kobling.
At være i stand til at isolere hjertemyocytter er en kraftfuld metode, der kan bruges til at forstå hjertets fysiologi, patologi og toksikologi. I ovenstående protokol, vi beskrev en metode, der udnytter en konstant tyngdekraften tryk Langendorff apparat til at opnå enkelt hjerte myocytter. Bagefter, ved hjælp af fluorescens fotometri system, vi beskriver, hvordan man samtidig erhverve enten calcium og afkortning eller spænding og afkortning spor.
På grund af de forskellige kinetik mellem calcium farvestoffer, skal der udvises forsigtighed, som farvestof til at vælge. For denne protokol, både Fura-2 og fluo-4 anvendes blev manipuleret med am estere nødvendiggør en vask trin for at give mulighed for intracellulære esteraser tid til at kløve am-gruppen og fælde farvestof i cellen. Mens både Fura-2 og fluo-4 betragtes som høj affinitet calcium farvestoffer, Kd for Fura-2 er 145 nM sammenlignet med 345 nM for fluo-49. Desuden er Fura-2 ratiometrisk. På grund af dette, det kan bruges til at kvantificere intracellulære calcium niveauer9,12. Fluo-4 på den anden side er en enkelt bølge calcium sonde. Fordelen ved at bruge fluo-4 er, at den giver et lysere fluorescens signal. Uanset hvilke calcium farvestof anvendes, sammenlignet med calcium farvestof, membranspænding sonder har en lavere SNR.
Som vist i figur 4 og figur 5er spændings spor sammenlignet med calcium spor mindre i amplitude. Ved hjælp af softwarens digitale sporings filtrering er det muligt at forøge SNR og kvantificere dataene (figur 4 og figur 7). Når de er kvantificeret, udviser både calcium transienter og optiske Apd’er tilbagegivelse, hvilket forkorter deres varighed ved hurtigere pacing (figur 2, figur 3, figur 6og figur 7). Kortere Apd’er under hurtigere pacing cyklusser er nødvendige for at give tilstrækkelig tid til ventrikel fyldning under diastole. Ændringer i dette fænomen menes at være tegn på en stigning i risikoen for rytmeforstyrrelser13,14,15,16. Mens ændringer i APD kan være forårsaget af sygdom, kan de også være forårsaget af kemikalier. Som vist i figur 7, når den fremherskende murine repolariserende kalium strøm, jegtil, er blokeret, den optiske APD bliver længere.
Stadig, som rapporteret tidligere med spændings følsomme farvestoffer, lysintensitet og varighed kan ændre APD2,5,17. Dette menes at være resultatet af genereringen af reaktive oxidativ arter (ros)5. Tidligere, det har vist sig, at tilsætning af antioxidanter til optagelsen løsning kan forhindre spændings følsomt farvestof cytotoksicitet5. Som et resultat, vi tilføjede antioxidant L-Glutathion (10 mM), at Tyrode løsning. Vist i figur 8 er de sidste 11 s af en 20 s optagelse opnået ved 1 Hz pacing. Som det fremgår af de røde pile, forekom ændringer i APD ikke før 15 s i optagelsen; Derfor, mens den modificerede Tyrode løsning ikke forhindrede fototoksicitet det forsinket det betydeligt. Ved hjælp af modificeret Tyrode løsning, ved hjælp af en lav lysstyrkeindstilling og holde varigheden af optagelsen til under 5 s, er det muligt at undgå enhver farve induceret ændringer i APD. Dette er vigtigt, fordi uden at passe på at undgå fototoksicitet, dataene kunne misfortolkes som forårsager tidligt eller forsinket efter depolariseringer. Ud over at begrænse eksponeringen for blåt lys, er der yderligere forholdsregler, der kan træffes for at forhindre fejlfortolkning af dataene.
Den første er kun at optage fra celler, der følger en til en pacing og har en hvile sarcomere længde større end eller lig med 1,75 μm. Den 1,75 μm cutoff er taget fra observation af Gordon et al.18 at spændinger hurtigt falder, når sarcomere længde er under dette beløb. Ikke desto mindre, visse patologier kan resultere i betydelige ændringer i hvile sarcomere længde. For at være sikker på, at Fænotypen er reel og ikke en artefakt af isolationen, bør følgende problemer skydning tilgange tages.
Hvis myocytter konsekvent ikke følger 1:1 pacing, har sarcomere længder under 1,75 μm, tung membran blebbing, eller ikke overleve isolationen, den første ting at kontrollere er den tid, det tog at kanyle hjertet. Jo længere kanyle tiden er, jo lavere vil udbyttet være. Hvis der kræves en lang kanyle tid, kan levedygtigheden forbedres ved at placere hjertet i en kardioplegisk opløsning19. Ikke desto mindre, fordi kollagenase er et enzym, aktivitet og specificitet af et bestemt parti ændre sig over tid. Hvis de samlede udbytter gradvist bliver værre trods gode kanyle tider, nye partier skal være analyseret. Mens vores protokol blev optimeret til 5 s optagelser, hvis der er behov for længere spændings spor, skal der købes yderligere neutrale tætheds filtre. Det system, der er beskrevet i protokollen, leveres med neutrale tætheds filtre, der reducerer det transmitterede lys med 37%, 50%, 75%, 90% og 95%.
Sammenfattende beskrev vi en metode, der tillod isolering af voksne murine ventrikulære myocytter, der blev brugt til calcium, spænding og sarcomere afkortning målinger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dana Morgenstern for omhyggelig korrekturlæsning af manuskriptet.
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |