हम मूत्र मायोसाइट्स के अलगाव के लिए कार्यप्रणाली प्रस्तुत करते हैं और एक साथ डिजिटल सेल ज्यामिति मापन के साथ फ्लोरेसेंस फोटोमेट्री का उपयोग करके सरकोवर को छोटा करने वाले निशान ों के साथ वोल्टेज या कैल्शियम के निशान कैसे प्राप्त करें।
वयस्क हृदय myocytes को अलग करने की क्षमता शोधकर्ताओं को एकल कोशिका स्तर पर हृदय विकृतियों की एक किस्म का अध्ययन करने की अनुमति दी है । जबकि कैल्शियम संवेदनशील रंगों में प्रगति ने एकल कोशिका कैल्शियम गतिशीलता की मजबूत ऑप्टिकल रिकॉर्डिंग की अनुमति दी है, मजबूत ट्रांसमेब्रेनऑप्टिकल वोल्टेज संकेतों की रिकॉर्डिंग मुश्किल बनी हुई है। यकीनन, यह कम एकल से शोर अनुपात, फोटोटॉक्सिकिटी और पारंपरिक शक्तिशाली रंगों की फोटोब्लीचिंग के कारण है। इसलिए, एकल सेल वोल्टेज माप लंबे समय से पैच क्लैंप तकनीक तक ही सीमित रहे हैं, जबकि सोने का मानक तकनीकी रूप से मांग कर रहा है और कम थ्रूपुट है। हालांकि, उपन्यास शक्तिशाली रंगों के विकास के साथ, वोल्टेज में परिवर्तन के लिए बड़े, तेज ऑप्टिकल प्रतिक्रियाओं को फोटोटॉक्सिकिटी और फोटोब्लीचिंग के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल विस्तार से बताता है कि वयस्क मूत्र मायोसाइट्स को कैसे अलग किया जाए जिसका उपयोग सेलुलर छोटा, कैल्शियम और ऑप्टिकल वोल्टेज मापन के लिए किया जा सकता है। विशेष रूप से, प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक रेशियोमेट्रिक कैल्शियम डाया, एक एकल उत्तेजना कैल्शियम रंग, और एक एकल उत्तेजना वोल्टेज रंगका का उपयोग करने के लिए । इस दृष्टिकोण का उपयोग विभिन्न रासायनिक एजेंटों की कार्डियोटॉक्सिकिटी और अतालता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि फोटोटॉक्सिकिटी अभी भी एकल कोशिका स्तर पर एक मुद्दा है, कार्यप्रणाली पर चर्चा की जाती है कि इसे कैसे कम किया जाए।
स्वस्थ और रोग राज्यों के दौरान दिल का अध्ययन करने के लिए, एकल कोशिका स्तर पर फेनोटाइप की जांच करना अक्सर उपयोगी होता है। जबकि वैज्ञानिक प्रगति एकल सेल कैल्शियम गतिशीलता के मजबूत माप की अनुमति दी है, एकल सेल ऑप्टिकल वोल्टेज मापदुर्लभ 1बने हुए हैं । यकीनन, यह शोर अनुपात (SNR), फोटोटॉक्सिसिटी, और पारंपरिक शक्तिशालीरंगों2,3के फोटोब्लीचिंग के लिए कम संकेत के कारण है। फिर भी, अलग माइकोसाइट ऑप्टिकल कार्रवाई क्षमता2,3,4प्राप्त किया गया है । इसके अलावा, रसायन विज्ञान में प्रगति और वोल्टेज संवेदनशील रंगों की भौतिकी के साथ, एसएनआर में5सुधार हुआ है । नई झिल्ली संभावित जांच(सामग्री की तालिका)उप-मिलीसेकंड में झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का जवाब देती है और प्रति 100 एमवी लगभग 25% की फ्लोरोजेनिक प्रतिक्रिया सीमा है। इसके अलावा, झिल्ली संभावित किट का उत्तेजना/उत्सर्जन (उदाहरण के लिए, फ्लूओवोल्ट; सामग्री की तालिका) इस प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है मानक फ्लोरेसिन आइसोथिओसाइनेट (एफईसी) या ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) सेटिंग्स6के साथ काम करता है।
जीएफसी और जीएफपी उत्तेजना/उत्सर्जन स्पेक्ट्रा फ्लोओ-4 कैल्शियम बाउंड स्पेक्ट्रा7के साथ ओवरलैप करते हैं । पारंपरिक रूप से डिजिटल सेल ज्यामिति मापन के साथ फ्लोरेसेंस फोटोमेट्री के एक साथ अधिग्रहण का उपयोग कैल्शियम और सेलुलर छोटा माप8के एक साथ अधिग्रहण के लिए किया गया है । यह प्रोटोकॉल विस्तार से वर्णन करता है कि murine myocytes को कैसे अलग किया जाए और मानक फ़ेसीसी सेटिंग्स का उपयोग करके कैल्शियम या वोल्टेज संकेतों को कैसे रिकॉर्ड किया जाए। इसके अतिरिक्त, यह बताता है कि इमेजिंग वर्कस्टेशन पर उत्तेजना/उत्सर्जन फिल्टर में एक साधारण स्विच का उपयोग अनुपात मीट्रिक कैल्शियम डाया फुरा-2 का उपयोग करके कैल्शियम और छोटा माप प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है । फ्लो-4 की तुलना में, फुरा-2 में कैल्शियम के लिए अधिक आत्मीयता होती है और यहअपेक्षाकृत 9फोटोब्लीचिंग के लिए प्रतिरोधी है। नतीजतन, एक ही वर्कस्टेशन का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल अकेले myocyte उत्तेजना-संकुचन युग्मन की एक पूरी तरह से जांच के लिए अनुमति देता है ।
कार्डियक माइओसाइट्स को अलग करने में सक्षम होना एक शक्तिशाली तरीका है जिसका उपयोग कार्डियक फिजियोलॉजी, पैथोलॉजी और विष विज्ञान को समझने के लिए किया जा सकता है। उपरोक्त प्रोटोकॉल में, हमने एक विधि का वर्णन किया जो एकल कार्डियक माइओसाइट्स प्राप्त करने के लिए निरंतर गुरुत्वाकर्षण दबाव लैंगेंडोर्फ तंत्र का उपयोग करती है। बाद में, फ्लोरेसेंस फोटोमेट्री सिस्टम का उपयोग करके, हम वर्णन करते हैं कि कैसे एक साथ कैल्शियम और छोटा या वोल्टेज और छोटा निशान प्राप्त करें।
कैल्शियम रंगों के बीच विभिन्न गतिज के कारण, देखभाल की जानी चाहिए जिस पर चयन करने के लिए रंगे। इस प्रोटोकॉल के लिए, दोनों fura-2 और फ्लोओ-4 इस्तेमाल किया AM esters के साथ इंजीनियर थे एक धोने के कदम की आवश्यकता के लिए इंट्रासेलुलर esterases समय के लिए अनुमति देने के लिए AM समूह क्लीव और सेल में रंगे जाल । जबकि दोनों फुरा-2 और फ्लोओ-4 उच्च आत्मीयता कैल्शियम रंग माना जाता है, फुरा-2 के लिए केडी फ्लो-49के लिए ३४५ एनएम की तुलना में १४५ एनएम है । इसके अलावा फुरा-2 रेशियोमेट्रिक है। इस वजह से, इसका उपयोग इंट्रासेलर कैल्शियम के स्तर9,12को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। दूसरी ओर फ्लो-4 एक ही तरंग कैल्शियम जांच है। फ्लो-4 का उपयोग करने का लाभ यह है कि यह एक उज्जवल फ्लोरेसेंस संकेत पैदा करता है। कैल्शियम के रंगे की तुलना में कैल्शियम डाया का उपयोग किया जाता है, झिल्ली वोल्टेज जांच में कम एसएनआर होता है।
जैसा कि चित्र 4 और चित्रा 5में दिखाया गया है, कैल्शियम के निशान की तुलना में वोल्टेज के निशान आयाम में छोटे होते हैं। सॉफ्टवेयर के डिजिटल ट्रेस फ़िल्टरिंग का उपयोग करके, एसएनआर को बढ़ाना और डेटा(चित्रा 4 और चित्रा 7)की मात्रा निर्धारित करना संभव है। एक बार मात्रा निर्धारित होने के बाद, कैल्शियम ट्रांसिएंट्स और ऑप्टिकल एपीडी दोनों क्षतिपूर्ति का प्रदर्शन करते हैं, तेजी से पेसिंग आवृत्तियों पर उनकी अवधि को छोटा करते हैं(चित्रा 2, चित्रा 3, चित्रा 6,और चित्रा 7)। डायस्टोल के दौरान वेंट्रिकुलर भरने के लिए पर्याप्त समय देने के लिए तेजी से पेसिंग चक्र ों के दौरान छोटे एपीडी आवश्यक हैं। इस घटना में परिवर्तन को13, 14,15,16के जोखिम में वृद्धि का संकेत माना जाता है . जबकि एपीडी में परिवर्तन बीमारी के कारण हो सकता है, वे भी रसायनों के कारण हो सकता है । जैसा कि चित्र 7में दिखाया गया है, जब प्रमुख मूत्र पोटेशियम वर्तमान को पुनर्ध्रुवीकृत करता है, तो मुझे अवरुद्ध कर दिया जाता है, ऑप्टिकल एपीडी लंबा हो जाता है।
फिर भी, जैसा कि पहले वोल्टेज संवेदनशील रंगों के साथ बताया गया था, प्रकाश तीव्रता और अवधि एपीडी2,5,17को बदल सकती है। यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीडेटिव प्रजातियों (ROS)5की पीढ़ी का परिणाम माना जाता है । पहले, यह दिखाया गया है कि रिकॉर्डिंग समाधान में एंटीऑक्सीडेंट के अलावा वोल्टेज संवेदनशील रंग साइटोटॉक्सिकिटी5को रोक सकता है। नतीजतन, हमने टाइरोड के समाधान में एंटीऑक्सीडेंट एल-ग्लूटाथिएक (10 एमएम) जोड़ा। चित्रा 8 में दिखाया गया है एक 20 एस रिकॉर्डिंग के अंतिम 11 एस 1 हर्ट्ज पेसिंग पर प्राप्त की है । जैसा कि लाल तीरों द्वारा इंगित किया गया है, एपीडी में परिवर्तन रिकॉर्डिंग में 15 एस तक नहीं होते थे; इसलिए, जबकि संशोधित टाइरोड के समाधान ने फोटोटॉक्सिकिटी को नहीं रोका, इसमें काफी देरी हुई। संशोधित टाइरोड के समाधान का उपयोग करना, कम प्रकाश तीव्रता सेटिंग का उपयोग करना और रिकॉर्डिंग की अवधि को 5 एस के तहत रखना, एपीडी में किसी भी रंग प्रेरित परिवर्तन से बचना संभव है। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि फोटोटॉक्सिकिटी से बचने के लिए ध्यान रखने के बिना, डेटा को ध्रुवीकरण के बाद जल्दी या देरी के कारण के रूप में गलत तरीके से समझा जा सकता है। नीली रोशनी के संपर्क को सीमित करने के अलावा, डेटा की गलत व्याख्या को रोकने के लिए अतिरिक्त सावधानियां बरती जा सकती हैं।
पहला कोशिकाओं से केवल रिकॉर्ड करना है जो एक से एक पेसिंग का पालन करते हैं और 1.75 माइक्रोन से अधिक या बराबर आराम करने वाली सरकोवर लंबाई होती है। १.७५ μm कटऑफ गॉर्डन एट अल द्वारा अवलोकन से लिया जाता है ।18 कि तनाव तेजी से गिरावट आती है एक बार sarcomere लंबाई इस राशि से नीचे है । फिर भी, कुछ विकृतियों के परिणामस्वरूप सरकोरे लंबाई को आराम करने में महत्वपूर्ण परिवर्तन हो सकते हैं। यह सुनिश्चित करने के लिए कि फेनोटाइप वास्तविक है और अलगाव का एक विरूपण साक्ष्य नहीं है, निम्नलिखित परेशानी शूटिंग दृष्टिकोण लिया जाना चाहिए।
यदि मायोसाइट्स लगातार 1:1 पेसिंग का पालन नहीं कर रहे हैं, तो 1.75 माइक्रोन से नीचे की सरकोरे लंबाई है, भारी झिल्ली ब्लबिंग, या अलगाव से बच नहीं पाते हैं, जांचने के लिए पहली बात यह है कि दिल को कैन्युलेट करने में लगने वाला समय है। कैनुलेशन का समय जितना लंबा होगा, पैदावार जितनी कम होगी। यदि एक लंबे कैनुलेशन समय की आवश्यकता है, तो दिल को कार्डियोप्लेजिक सॉल्यूशन19में रखकर व्यवहार्यता में सुधार किया जा सकता है। बहरहाल, क्योंकि कोलेजन एक एंजाइम है, गतिविधि और समय के साथ एक विशिष्ट बहुत परिवर्तन की विशिष्टता । यदि समग्र पैदावार उत्तरोत्तर अच्छा कैनुलेशन समय के बावजूद बदतर हो जाते हैं, तो नए लॉट को परख दिया जाना चाहिए। जबकि हमारे प्रोटोकॉल को 5 एस रिकॉर्डिंग के लिए अनुकूलित किया गया था, यदि लंबे समय तक वोल्टेज निशान की आवश्यकता है, तो अतिरिक्त तटस्थ घनत्व फिल्टर खरीदे जाने की आवश्यकता होगी। प्रोटोकॉल में वर्णित प्रणाली तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ आती है जो संचारित प्रकाश को 37%, 50%, 75%, 90%, और 95% तक कम करती है।
संक्षेप में, हमने एक पद्धति का वर्णन किया है जिसने वयस्क मूत्र वेंट्रिकुलर माइओसाइट्स के अलगाव के लिए अनुमति दी थी जिसका उपयोग कैल्शियम, वोल्टेज और सरकोवर छोटा माप के लिए किया जाता था।
The authors have nothing to disclose.
हम पांडुलिपि के सावधानीपूर्वक प्रूफरीडिंग के लिए दाना मोर्गेनस्टर्न का शुक्रिया अदा करते हैं।
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |