Vi presenterer metodikk for isolering av murine myocytter og hvordan du skaffer spenning eller kalsium spor samtidig med sarkomerlengde forkorte spor ved hjelp av fluorescens fotometri med samtidige digitale celle geometri målinger.
Evnen til å isolere voksen CARDIAC myocytter har tillatt forskere å studere en rekke CARDIAC patologi på enkelt cellenivå. Mens fremskritt i kalsium følsomme fargestoffer har tillatt den robuste optiske innspillingen av enkelt celle kalsium dynamikk, opptak av robuste transmembrane optiske spennings signaler har vært vanskelig. Uten tvil, dette er på grunn av den lave enkelt-til-støy-forhold, Phototoksisitet, og photobleaching av tradisjonelle potensiometrisk fargestoffer. Derfor har én celle spennings målinger lenge vært begrenset til plasteret klemme teknikk som mens gullstandarden, er teknisk krevende og lav gjennomstrømming. Men med utviklingen av romanen potensiometrisk fargestoffer, store, raske optiske reaksjoner på endringer i spenning kan fås med liten eller ingen Phototoksisitet og photobleaching. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du isolerer voksen murine myocytter som kan brukes for mobilnettet forkortelse, kalsium, og optisk spenning målinger. Nærmere bestemt beskriver protokollen hvordan du bruker en ratiometrisk kalsium fargestoff, en enkelt-eksitasjon kalsium fargestoff, og en enkelt eksitasjon spenning fargestoff. Denne tilnærmingen kan brukes til å vurdere Kardiotoksisitet og arrhythmogenicity av ulike kjemiske stoffer. Mens Phototoksisitet er fortsatt et problem på enkelt cellenivå, er metodikk diskutert om hvordan å redusere den.
For å studere hjertet under sunne og patologiske tilstander, er det ofte nyttig å undersøke fenotype på enkelt cellenivå. Mens vitenskapelige fremskritt har tillatt den robuste måling av enkelt celle kalsium dynamikk, har én celle optisk spenning målinger forble knappe1. Uten tvil, dette er på grunn av det lave signalet til støyforhold (SNR), Phototoksisitet, og photobleaching av tradisjonelle potensiometrisk fargestoffer2,3. Likevel har isolert myocyte optisk handling potensialer blitt innhentet2,3,4. Videre, med fremskritt innen kjemi og fysikk av spennings følsomme fargestoffer, har SNR forbedret5. Nyere membran potensielle sonder (tabell av materialer) reagerer på endringer i membran potensialet i sub-millisekunder og har et fluorogenic respons område på ca. 25% per 100 mv. Videre eksitasjon/utslipp av membranen potensialet Kit (f. eks FluoVolt; Tabell med materialer) brukes i denne protokollen fungerer med standard fluorescein isothiocyanate (FITC) eller grønt fluorescerende protein (GFP) innstillinger6.
FITC og GFP eksitasjon/utslipp Spectra overlapper med fluo-4 kalsium bundet Spectra7. Samtidig anskaffelse av fluorescens fotometri med digitale celle geometri målinger tradisjonelt har blitt brukt for samtidig anskaffelse av kalsium og cellulære forkorte målinger8. Denne protokollen beskriver i detalj hvordan du isolerer murine myocytter og hvordan du registrerer kalsium-eller spennings signaler ved hjelp av standard FITC-innstillinger. I tillegg beskriver det hvordan en enkel bryter i eksitasjon/utslipps filtre på Imaging arbeidsstasjonen kan brukes til å få kalsium og forkorte målinger ved hjelp av forholdet metrisk kalsium fargestoff fura-2. Sammenlignet med fluo-4, har fura-2 en høyere affinitet for kalsium og er relativt motstandsdyktig mot photobleaching9. Følgelig, ved hjelp av en enkelt arbeidsstasjon denne protokollen gir en grundig undersøkelse av enkeltvis myocyte eksitasjon-sammentrekning kopling.
Å kunne isolere CARDIAC myocytter er en kraftig metode som kan brukes til å forstå hjerte fysiologi, patologi og toksikologiske. I protokollen ovenfor, beskrev vi en metode som utnytter en konstant gravitasjon press Langendorff apparat for å få enkelt CARDIAC myocytter. Etterpå, ved hjelp av fluorescens fotometri systemet, beskriver vi hvordan du samtidig erverve enten kalsium og forkortelse eller spenning og forkorte spor.
På grunn av de ulike Kinetics mellom kalsium fargestoffer, må forsiktighet tas på hvilke fargestoff å velge. For denne protokollen, både fura-2 og fluo-4 brukes var konstruert med AM estere nødvendiggjør en vask skritt for å tillate intracellulære esterazami tid til å holde fast i AM gruppe og felle fargestoff i cellen. Mens både fura-2 og fluo-4 anses som høy affinitet kalsium fargestoffer, er KD for fura-2 145 nM sammenlignet med 345 nM for fluo-49. Videre er fura-2 ratiometrisk. På grunn av dette, kan det brukes til å kvantifisere intracellulære kalsium nivåer9,12. Fluo-4 på den annen side er en enkelt bølge kalsium sonde. Fordelen med å bruke fluo-4 er det gir en lysere fluorescens signal. Uansett hvilke kalsium fargestoff brukes, i forhold til kalsium fargestoff, membran spennings sonder har en lavere SNR.
Som vist i Figur 4 og figur 5, spennings spor i forhold til kalsium spor er mindre i amplitude. Ved hjelp av programvaren digitale sporings filtrering, er det mulig å øke SNR og kvantifisere dataene (Figur 4 og figur 7). Når kvantifisert, både kalsium transienter og optisk APD demonstrere restitusjon, forkorte varigheten på raskere pacing frekvenser (figur 2, Figur 3, figur 6, og figur 7). Kortere APD under raskere pacing sykluser er nødvendig for å gi nok tid til ventrikkel fylling under diastolen. Endringer i dette fenomenet antas å være en indikasjon på en økning i risikoen for arrythmias13,14,15,16. Mens endringer i APD kan være forårsaket av sykdom, kan de også være forårsaket av kjemikalier. Som vist i figur 7, når den dominerende murine repolarizing kalium strøm, jegtil, er blokkert, den optiske APD blir lengre.
Likevel, som rapportert tidligere med spennings følsomme fargestoffer, lys intensitet og varighet kan endre APD2,5,17. Dette antas å være et resultat av generering av reaktive oksidativt arter (ROS)5. Tidligere har det vært vist at tilsetning av antioksidanter til innspillingen løsningen kan hindre spennings følsomme fargestoff cytotoksisitet5. Som et resultat, la vi til antioksidant L-glutation (10 mM), til Tyrode ‘ s løsning. Vist i Figur 8 er de siste 11 s av en 20 s innspilling innhentet på 1 Hz pacing. Som indikert av de røde pilene, endringer i APD ikke skje før 15 s inn i opptaket; Derfor, mens den modifiserte Tyrode ‘ s løsning ikke hindre Phototoksisitet det forsinket det betydelig. Bruke modifisert Tyrode ‘ s løsning, ved hjelp av en lav lys intensitet innstilling og holde varigheten av opptaket til under 5 s, er det mulig å unngå eventuelle Dye indusert endringer i APD. Dette er viktig fordi uten å ta vare for å unngå Phototoksisitet, kan dataene bli misforstått som forårsaker tidlig eller forsinket etter depolarizations. I tillegg til å begrense eksponeringen til blått lys, er det flere forholdsregler som kan iverksettes for å forhindre feil tolkning av dataene.
Den første er å bare spille inn fra celler som følger en til en pacing og har en hvile sarkomerlengde lengde større enn eller lik 1,75 μm. 1,75 μm-grensen er tatt fra observasjon av Gordon et al.18 at spenningen raskt synker når sarkomerlengde lengde er under dette beløpet. Likevel kan visse sykdommer føre til betydelige endringer i hvile sarkomerlengde lengde. For å være sikker på at fenotype er reell og ikke en gjenstand av isolasjonen, bør følgende feilsøking tilnærminger tas.
Hvis myocytter er konsekvent ikke etter 1:1 pacing, har sarkomerlengde lengder under 1,75 μm, tung membran blebbing, eller ikke overleve isolasjonen, den første tingen å sjekke er tiden det tok å kannelerer hjertet. Jo lenger kanyleringen tid, jo lavere avkastning vil være. Hvis en lang kanyleringen tid er nødvendig, kan levedyktigheten forbedres ved å plassere hjertet i en cardioplegic løsning19. Likevel, fordi kollagenase er et enzym, aktiviteten og spesifisitet av et bestemt parti endres over tid. Hvis den samlede gir gradvis blitt verre til tross for gode kanyleringen ganger, bør nye tomter være analyseres. Mens vår protokoll ble optimalisert for 5 s innspillinger, hvis lengre spennings spor er nødvendig, vil ytterligere nøytral tetthet filtre må kjøpes. Systemet er beskrevet i protokollen kommer med nøytral tetthet filtre som reduserer overført lys med 37%, 50%, 75%, 90%, og 95%.
Oppsummert beskrev vi en metodikk som tillot isolering av voksen murine ventrikkel myocytter som ble brukt for kalsium, spenning, og sarkomerlengde forkorte målinger.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dana Morgenstern for forsiktig korrekturlesing av manuskriptet.
0.25 Liter Water Jacketed Reservoir | Radnoti, LLC | 120142-025 | |
1 liter volumetric flask | Fisher Scientific | 10-205F | |
100 ml beaker | Fisher Scientific | FB-100-100 | |
100 ml graduated cylinder | Fisher Scientific | 08 562 5C | |
1000 ml flask | Fisher Scientific | FB-500-1000 | |
2-Bar Lab Stand with Stabilizer Bar and 24" Stainless Steel Rods | Radnoti, LLC | 159951-2 | |
4-Aminopyridine | Sigma-Aldrich | 275875 | |
40X Oly UApo/340 Non-Immersion Objective (NA 0.9, WD 0.2mm) | IonOptix | MSCP1-40 (b) | |
60-mL syringe, BD Luer-Lok tip | BD | 309650 | |
Aortic Metal Cannulae | Harvard Apparatus | 73-0112 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP9703-100 | |
C-6 Standard Heating Circulator | Chemyx | A30006 | |
CaCl2 | Fisher Scientific | BP510500 | |
Cell framing adapter | IonOptix | CFA300 | |
CellPr0 Vacuum Filtration System, 1 liter, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V100022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 250mL, 0.22µm,Cs/12 | Labratory Product Sales, Inc | V25022 | |
CellPro Vacuum Filtration System, 500mL, 0.22µm,12/CS | Labratory Product Sales, Inc | V50022 | |
CMC (mTCII) Temp Control w/ inline flow heater | IonOptix | TEMPC2 | |
Cole-Parmer Large-bore 3-way, male-lock, stopcocks | Cole-Parmer | EW-30600-23 | |
Cole-Parmer Luer fittings, Large-bore stopcocks, male lock, 4-way | Cole-Parmer | EW-30600-12 | |
Cole-Parmer Stopcocks with Luer Connections; 1-way; male slip | Cole-Parmer | EW-30600-01 | |
Collagenase Type II | Worthington | LS004177 | |
Corning Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | 07-201-432 | |
Dell Optiplex 790 mini-tower, 4G RAM, 250G HD, Windows 7 Pro | IonOptix | CPUD7M | |
DMSO | Fisher Scientific | 50980367 | |
Dumont Tweezers Style 5 | Amazon | B00F70ZDEQ | |
FHD Rapid Change Stimulation Chamber | IonOptix | FHDRCC1 | |
Fluo-3/4 Optics Package | IonOptix | IonOP-Fluo | |
Fluorescence system interface – (w PCI-I/O card) | IonOptix | FSI700 | |
Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Glucose | Fisher Scientific | D16-1 | |
Hemostat, Curved 5-1/2" | Amazon | B00GGAAPD0 | |
HEPES | Fisher Scientific | BP310500 | |
HyperSwitch dual excitation light source | IonOptix | HSW400 | |
Inverted Motic Fluorescence Microscope | IonOptix | MSCP1-40 (a) | |
IonWizard Core + Analysis | IonOptix | IONWIZ | |
Iris Scissors, curved | Amazon | B018KRRMY6 | |
K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-100 | |
KCl | Fisher Scientific | BP3661 | |
L-Glutathione reduced | Sigma-Aldrich | G4251 | |
LOOK Silk Spool, Black Braided, 4-0, 100yds | SouthernAnesthesiaSurgical Inc. | SP116-EA | |
M199 Media | Fisher Scientific | 12 340 030 | |
MgCl2 | Fisher Scientific | MP021914215 | |
MgSO4 | Fisher Scientific | BP2131 | |
MyoCam-S Digital CCD video system | IonOptix | MCS100 | |
MyoPacer Field Stimulator | IonOptix | MYP100 | |
NaCl | Fisher Scientific | BP358212 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | 56-754-9250GM | |
Oxygenator Bubbler with Fluid Inlet for 0.25 Liter | Radnoti, LLC | 140143-025 | |
Photomultiplier sub-system | IonOptix | PMT400 | |
PMT Acquisition add-on | IonOptix | PMTACQ | |
Radnoti Heating Coil 5 mL with Degasing Trap | Radnoti, LLC | 158830 | |
Ring Clamp 60 – 80mm Dia. for 250ml Reservoir | Radnoti, LLC | 120141-025 | |
Ring Clamp for Bubble Trap Compliance Chamber | Radnoti, LLC | 120149RC | |
Saint-Gobain ACF000010 5/32 in.9/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-214 | |
Saint-Gobain ACF000013 3/16 in.3/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-217 | |
Saint-Gobain ACF000016 1/4 in.5/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-219 | |
Saint-Gobain ACF000025 5/16 in.5/8 in. | Fisher Scientific | 14-171-226 | |
Saint-Gobain ACF00003 1/16 in.3/16 in. | Fisher Scientific | 14-171-209 | |
Saint-Gobain ACF00005 1/16 in.3/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-210 | |
Saint-Gobain ACF00009 5/32 in.7/32 in. | Fisher Scientific | 14-171-213 | |
Sarcomere Length Recording add-on | IonOptix | SARACQ | |
T/C Adson Tissue Platic Surgery Forceps 4.75" | Amazon | B00JDWRBGC | |
VETUS Anti-Static Curved Tip Tweezers | Amazon | B07QMZC94J | |
Vistek 3200 Motic Vibration Isolation Platform | IonOptix | ISO100 |