एक Microfluidic चिप के साथ एक निर्धारणात्मक मैनर में एकल सेल आधारित सह संस्कृति की स्थापना
Summary
यह रिपोर्ट एकल कोशिका संस्कृति प्रयोग स्थापित करने के लिए एक माइक्रोफ्लूइड चिप-आधारित विधि का वर्णन करती है जिसमें कई एकल कोशिकाओं के उच्च दक्षता युग्मन और सूक्ष्म विश्लेषण प्राप्त किए जा सकते हैं।
Abstract
सेल सह संस्कृति परख व्यापक रूप से विभिन्न प्रकार के सेल प्रकार के बीच सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए बेहतर कैंसर सहित रोगों के जीव विज्ञान को समझने के लिए इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, पारंपरिक सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग करके अत्यधिक विषम कोशिका आबादी में अंतरकोशिकीय अन्योन्यक्रियाओं के जटिल तंत्र को स्पष्ट करना चुनौतीपूर्ण है क्योंकि कोशिका उपजनसंख्या की विषमता औसत मूल्यों से अस्पष्ट है; पारंपरिक सह-संस्कृति प्रणालियों का उपयोग केवल जनसंख्या संकेत का वर्णन करने के लिए किया जा सकता है, लेकिन व्यक्तिगत कोशिकाओं के व्यवहार को ट्रैक करने में असमर्थ हैं। इसके अलावा, पारंपरिक एकल सेल प्रयोगात्मक तरीकों क्योंकि Poison वितरण के सेल हेरफेर में कम दक्षता है. Microfabricated उपकरणों एकल सेल अध्ययन के लिए एक उभरती हुई तकनीक है क्योंकि वे सही उच्च throughput पर एकल कोशिकाओं में हेरफेर कर सकते हैं और नमूना और अभिकर्मक खपत को कम कर सकते हैं. यहाँ, हम अवधारणा और कई एकल सेल सह संस्कृति के लिए एक microfluidic चिप के आवेदन का वर्णन. चिप कुशलतापूर्वक एक संस्कृति कक्ष में एकल कोशिकाओं के कई प्रकार पर कब्जा कर सकते हैं ($46%) और एकल-सेल स्तर पर सेल-सेल इंटरैक्शन के तहत कोशिकाओं के व्यवहार (उदा., माइग्रेशन, प्रसार, आदि) का अध्ययन करने के लिए पर्याप्त संस्कृति स्थान उपयोगी है। लसीका endothelial कोशिकाओं और मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा जीने के लिए कई एकल सेल बातचीत अध्ययन के लिए microfluidic मंच पर एक एकल सेल सह संस्कृति प्रयोग करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
Introduction
एकल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार के कुशल कब्जा और पर्याप्त संस्कृति स्थान प्रदान एकल कोशिकाओं के कई प्रकार के एकल सह संस्कृति प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं1. कमजोर पड़ने को सीमित करना आवश्यक उपकरणों की कम लागत के कारण, ऐसे प्रयोगों के लिए एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला तरीका है। हालांकि, Poison वितरण सीमा के कारण, अधिकतम एकल सेल अधिग्रहण संभावना केवल 37% है, प्रयोगात्मक आपरेशन कठिन और समय लेने वाली2बना रही है. इसके विपरीत, फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कर उच्च कुशलता से एकल कोशिकाओं को तैयार करने के लिए Poison वितरण सीमा को दूर कर सकते हैं3. तथापि, महंगे इंस्थाइनेशन और अनुरक्षण लागत के कारण एफएसीएस कुछ प्रयोगशालाओं तक सुलभ नहीं हो सकता है। माइक्रोफेब्रिडेभित उपकरणों को हाल ही में एकल सेल ट्रैपिंग4,सिंगल सेल युग्मन5,और एकल सेल कल्चर अनुप्रयोगों के लिए विकसित किया गया है। इन उपकरणों को सही एकल कोशिकाओं में हेरफेर करने की क्षमता के आधार पर फायदेमंद होते हैं6,उच्च throughput प्रयोगों प्रदर्शन, या नमूना और अभिकर्मक खपत को कम. हालांकि, वर्तमान microfluidic उपकरणों के साथ कई सेल प्रकार के साथ एकल सेल सह संस्कृति प्रयोगों प्रदर्शन अभी भी Poisson वितरण1,7,8, या की अक्षमता की सीमा के कारण चुनौतीपूर्ण है उपकरणों एकल कोशिकाओंकेदो से अधिक प्रकार पर कब्जा करने के लिए 4,5,6,9,10.
उदाहरण के लिए, योन एट अल. सेल सेल बातचीत अध्ययन11के लिए एक microfluidic डिवाइस की सूचना दी. यह डिवाइस कोशिकाओं को एक कक्ष में युग्मित करने के लिए गुणनात्मक विधि का उपयोग करता है. हालांकि, यह केवल डिवाइस संरचना में ज्यामितीय प्रतिबंधों के कारण दो अलग-अलग सेल प्रकारों की युग्मन प्राप्त कर सकता है। ली एट अल से एक और रिपोर्ट पर कब्जा करने और एकल कोशिकाओं12जोड़ी के लिए एक नियतात्मक विधि का प्रदर्शन किया. इस डिवाइस नियतात्मक विधि से बाँधना दक्षता बढ़ जाती है, लेकिन यह लंबे समय तक आपरेशन कोशिकाओं जोड़ी के लिए आवश्यक समय तक सीमित है. विशेष रूप से, दूसरा सेल कैप्चर केवल 24 ज के बाद सतह से जुड़ा हुआ है के बाद किया जा सकता है. झाओ एट अल. एक एकल सेल13के दो प्रकार पर कब्जा करने के लिए एक छोटी बूंद आधारित microfluidic डिवाइस की सूचना दी। हम यह पाया जा सकता है कि छोटी बूंद-आधारित माइक्रोफ्लूइडिक डिवाइस अभी भी पॉइसन वितरण तक सीमित है और केवल गैर-अनुलग्न कोशिकाओं पर उपयोग किया जा सकता है, और खेती की प्रक्रिया के दौरान संस्कृति समाधान को बदलना संभव नहीं है।
पहले, हमने एक माइक्रोफ्लुइडिक “हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप” विकसित की है जो नियतात्मक हाइड्रोडायनामिक बलों का उपयोग संस्कृति कक्ष में एकल-सेल के कई प्रकार ों पर कब्जा करने के लिए करता है और बाद में सेल सह-संस्कृति प्रयोग का विश्लेषण करने के लिए प्रदर्शन कर सकता है व्यक्तिगत सेल प्रवास व्यवहार के तहत सेल सेल बातचीत14| हाइड्रोडायनामिक शटलिंग चिप में इकाइयों के एक सरणीवाले ससेट शामिल होते हैं जिनमें प्रत्येक में सर्पाकार उप-पास चैनल, एक कैप्चर-साइट, और एक संस्कृति कक्ष होता है। सर्पिन बाइ-पास चैनल और संस्कृति कक्ष के बीच प्रवाह प्रतिरोध में अंतर का उपयोग करके, और एक विशेष रूप से डिजाइन आपरेशन प्रक्रिया, एकल कोशिकाओं के विभिन्न प्रकार बार बार संस्कृति कक्ष में कब्जा कर लिया जा सकता है. विशेष रूप से, संस्कृति कक्ष के पर्याप्त स्थान न केवल सेल पर कब्जा करने के दौरान बाहर निकाल दिया जा रहा से सेल को रोका जा सकता है, लेकिन यह भी कोशिकाओं के प्रसार के लिए पर्याप्त स्थान प्रदान करते हैं, proliferate और माइग्रेट, लाइव एकल सेल बातचीत के अवलोकन के लिए अनुमति देता है. इस आलेख में, हम इस डिवाइस और विस्तृत प्रोटोकॉल चरणों के उत्पादन पर ध्यान केंद्रित।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर सूक्ष्म पर्यावरण में विभिन्न कोशिकाओं के अंतरकोशिकीय अन्योन्यक्रिया ट्यूमर17की प्रगति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं . सेल-सेल अन्योन्यक्रियाओं के तंत्र को समझने के लिए सह-संवर…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (105-2628-ई-400-001-MY2) से अनुदान और ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्योजी चिकित्सा, राष्ट्रीय चुंग सिंग विश्वविद्यालय और राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों में पीएच.डी. कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
