إنشاء الثقافات المشتركة القائمة علي خليه واحده بطريقه قطعيه مع رقاقه ميكروفلويدريك
Summary
يصف هذا التقرير أسلوبا قائما علي الرقاقات الصغيرة لاعداد تجربه ثقافة خليه واحده يمكن فيها تحقيق الاقتران العالي الكفاءة والتحليل المجهري للخلايا المفردة المتعددة.
Abstract
وقد استخدمت اختبارات الثقافة المشتركة للخلايا علي نطاق واسع لدراسة تفاعلات خلايا الخلايا بين أنواع الخلايا المختلفة لفهم بيولوجيا الامراض بما في ذلك السرطان بشكل أفضل. ومع ذلك ، فانه من الصعب توضيح اليه المعقدة للتفاعلات بين الخلايا في سكان الخلايا غير المتجانسة بشكل كبير باستخدام نظم الثقافة المشتركة التقليدية لان عدم تجانس الخلايا الفرعية تحجبه القيم المتوسطة ؛ يمكن استخدام أنظمه الثقافة المشتركة التقليدية فقط لوصف اشاره السكان ، ولكنها غير قادره علي تتبع سلوك الخلايا الفردية. وعلاوة علي ذلك ، فان الأساليب التجريبية أحاديه الخلية التقليدية لها كفاءه منخفضه في التلاعب بالخلايا بسبب توزيع بواسون. الاجهزه المجهرية هي التكنولوجيا الناشئة للدراسات خليه واحده لأنها يمكن التلاعب بدقه خلايا واحده في الانتاجيه العالية ويمكن ان تقلل من استهلاك العينات والكاشف. هنا ، ونحن وصف مفهوم وتطبيق رقاقه ميكروفلويدريك لمتعددة خليه واحده الثقافات المشتركة. رقاقه يمكن التقاط بكفاءة أنواع متعددة من خلايا واحده في غرفه الثقافة (~ 46 ٪) ولديها مساحة ثقافيه كافيه مفيده لدراسة سلوك الخلايا (علي سبيل المثال ، الهجرة ، والانتشار ، وما إلى ذلك) تحت التفاعل خليه خليه علي مستوي خليه واحده. تم استخدام خلايا البطانة اللمفاوية وسرطان الخلايا الحرشفية عن طريق الفم لاجراء تجربه الثقافة المشتركة أحاديه الخلية علي منصة ميكروفلويديك لدراسات تفاعليه متعددة الخلايا الحية.
Introduction
وهناك حاجه للتقاط الكفاءة للأنواع المختلفة من الخلايا المفردة وتوفير مساحة ثقافيه كافيه لتجارب الاستزراع المشترك للخلايا الواحدة لأنواع متعددة من الخلايا المفردة1. الحد من التخفيف هو الأسلوب الأكثر استخداما لاعداد الخلايا المفردة لمثل هذه التجارب ، وذلك بسبب انخفاض تكلفه المعدات المطلوبة. ومع ذلك ، نظرا لمحدوديه توزيع بواسون ، فان الحد الأقصى لاحتمال اكتساب الخلايا المفردة هو فقط 37% ، مما يجعل العملية التجريبية شاقه وتستغرق وقتا طويلا2. في المقابل ، يمكن استخدام الفرز الخلية المنشطة مضان (FACS) التغلب علي الحد من التوزيع Poisson لاعداد عاليه كفاءه خلايا واحده3. ومع ذلك ، فقد لا يمكن لبعض المختبرات الوصول اليها بسبب تكلفه الاجهزه المكلفة وتكاليف الصيانة. تم تطوير الاجهزه المجهرية مؤخرا لتراكب الخلية الواحدة4، واقتران الخلية المفردة5، وتطبيقات ثقافة الخلية المفردة. هذه الاجهزه هي مفيده استنادا إلى قدرتها علي التلاعب بدقه خلايا واحده6، وأداء التجارب عاليه الانتاجيه ، أو تقليل العينة والاستهلاك كاشف. ومع ذلك ، فان اجراء تجارب الثقافة المشتركة أحاديه الخلية مع أنواع الخلايا المتعددة مع الاجهزه ميكروفلويديك الحالية لا تزال صعبه بسبب الحد من poisson توزيع1،7،8، أو عدم قدره الاجهزه للتقاط أكثر من نوعين من خلايا واحده4،5،6،9،10.
فعلي سبيل المثال ، ابلغ يون وآخرون عن جهاز ميكروفلوريك لدراسة التفاعل بين الخلايا الخلوية11. يستخدم هذا الجهاز أسلوب احتماليه لاقران الخلايا في غرفه واحده. ومع ذلك ، فانه يمكن فقط تحقيق الاقتران بين نوعين مختلفين من الخلايا بسبب القيود الهندسية في بنيه الجهاز. واظهر تقرير آخر من لي وآخرون طريقه قطعيه للتقاط واقران الخلايا المفردة12. يزيد هذا الجهاز من كفاءه الاقران بواسطة الطريقة القطعية ولكنه محدود بوقت التشغيل المطول المطلوب لاقران الخلايا. وعلي وجه التحديد ، يمكن اجراء عمليه التقاط الخلية الثانية فقط بعد إرفاق الخلية الملتقطة الاولي بالسطح بعد 24 ساعة. وابلغ جاو وآخرون عن وجود جهاز ميكروفلويدريك يستند إلى القطرات للتقاط نوعين من الخلية الواحدة13. يمكننا العثور علي ان الجهاز ميكروفلويديك القائم علي الحبريه لا يزال يقتصر علي توزيع poisson ويمكن استخدامها فقط علي الخلايا غير المرفقة ، وانه ليس من الممكن لتغيير الحل الثقافة اثناء عمليه الزراعة.
في السابق ، قمنا بتطوير “رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية” التي تستخدم قوي هيدروديناميكية حتمية للتقاط أنواع متعددة من خليه واحده في غرفه الثقافة ويمكن ان تؤدي في وقت لاحق تجربه الخلية المشتركة في الثقافة لتحليل سلوك ترحيل الخلية الفردية ضمن تفاعلات خليه الخلية14. وتتالف رقاقه الإغلاق الهيدروديناميكية من مجموعات من الوحدات التي تحتوي كل منها علي قناه ملتوية بتمريره ، وموقع للتقاط الصور ، وغرفه للثقافة. باستخدام الفرق في مقاومه التدفق بين القناة التي يمر بها اعوج وغرفه الثقافة ، وإجراءات التشغيل المصممة خصيصا ، يمكن التقاط أنواع مختلفه من الخلايا المفردة بشكل متكرر في غرفه الثقافة. ومن الجدير بالملاحظة ان المساحة الوافرة للغرفة الثقافية لا يمكن ان تمنع الخلية من ان يتم مسحها اثناء التقاط الخلايا فحسب ، بل توفر أيضا مساحة كافيه للخلايا للانتشار والتكاثر والهجرة ، مما يسمح بمراقبه التفاعلات الحية أحاديه الخلية. في هذه المقالة ، ونحن نركز علي إنتاج هذا الجهاز وخطوات بروتوكول مفصله.
Protocol
Representative Results
Discussion
يلعب ال [اينترخلوي] تفاعلات من خلايا مختلفه في الورم [ميكروبيئه] دور مهمة في التقدم من الورم17. ومن أجل فهم اليه تفاعلات الخلايا الخلوية ، تستخدم نظم الثقافة المشتركة كطريقه تحليليه مشتركه. ومع ذلك ، فان أنواع الخلايا المتعددة وتباين الخلايا نفسها قد أدت إلى تعقيدات تجريبية وصع…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان هذا العمل مدعوما بمنحه من وزاره العلوم والتكنولوجيا (105-2628-400-001-MY2) ، وبرنامج الدكتوراه في هندسه الانسجه والطب التجديدي ، وجامعه تشونغ شينج الوطنية ، ومعاهد البحوث الصحية الوطنية.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
