Het opzetten van eencellige co-culturen op een deterministische manier met een Microfluïdische chip
Summary
Dit rapport beschrijft een microfluïdische chip-gebaseerde methode voor het opzetten van een eencelkweek experiment waarbij hoogrenderende koppeling en microscopische analyse van meerdere afzonderlijke cellen kunnen worden bereikt.
Abstract
Celco-cultuur assays zijn op grote schaal gebruikt voor het bestuderen van celcelinteracties tussen verschillende celtypen om beter te begrijpen van de biologie van ziekten met inbegrip van Cancer. Het is echter een uitdaging om het complexe mechanisme van intercellulaire interacties in zeer heterogene celpopulaties te verduidelijken met behulp van conventionele co-cultuur systemen, omdat de heterogeniteit van de celsubpopulatie wordt bedekt door de gemiddelde waarden; de conventionele co-cultuur systemen kunnen alleen worden gebruikt om het bevolkings signaal te beschrijven, maar zijn niet in staat om het gedrag van individuele cellen te volgen. Bovendien hebben conventionele eencellige experimentele methoden een lage efficiëntie bij het manipuleren van cellen vanwege de Poisson-verdeling. Micro fabricaat-apparaten zijn een opkomende technologie voor eencellige studies omdat ze afzonderlijke cellen nauwkeurig kunnen manipuleren bij hoge doorvoer en het monster-en reagens verbruik kunnen verminderen. Hier beschrijven we het concept en de toepassing van een microfluïdische chip voor meerdere eencellige co-culturen. De chip kan efficiënt meerdere soorten afzonderlijke cellen in een cultuur kamer vastleggen (~ 46%) en heeft een voldoende cultuur ruimte die nuttig is om het gedrag van de cellen te bestuderen (bijv. migratie, proliferatie, enz.) onder celcelinteractie op het eencellige niveau. Lymfatische endotheliale cellen en oraal plaveiselcelcarcinoom werden gebruikt om een eencellige co-cultuur experiment uit te voeren op het microfluïdische platform voor Live meervoudige interactiestudies met één cel.
Introduction
Efficiënte inname van verschillende soorten afzonderlijke cellen en het verstrekken van voldoende cultuur ruimte zijn nodig voor co-cultuur experimenten met één cel van meerdere typen enkelvoudige cellen1. Beperkende verdunning is de meest gebruikte methode om de afzonderlijke cellen voor dergelijke experimenten voor te bereiden, vanwege de lage kosten van de benodigde apparatuur. Vanwege de Poisson-verdelings beperking is de maximale kans op een enkelvoudige celverwerving echter slechts 37%, waardoor de experimentele operatie moeizaam en tijdrovend is2. Daarentegen kan het gebruik van fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) de Poisson-verdelings begrenzing overwinnen tot hoog-efficiënt enkelvoudige cellen voorbereiden3. FACS is echter mogelijk niet toegankelijk voor sommige laboratoria vanwege dure instrumentatie-en onderhoudskosten. Micro fabricaat-apparaten zijn onlangs ontwikkeld voor single cell-overvulling4, eencellige pairing5en toepassingen voor één celcultuur. Deze apparaten zijn voordelig op basis van hun vermogen om nauwkeurig individuele cellen te manipuleren6, uitvoeren van experimenten met hoge doorvoer, of verminderen van monster en reagens verbruik. Het uitvoeren van eencellige co-cultuur experimenten met meerdere celtypen met de huidige microfluïdische apparaten is echter nog steeds een uitdaging vanwege de beperking van Poisson-distributie1,7,8of het onvermogen van de apparaten om meer dan twee soorten afzonderlijke cellen vast te leggen4,5,6,9,10.
Bijvoorbeeld, Yoon et al. rapporteerde een microfluïdisch apparaat voor cel-cel interactiestudie11. Dit apparaat gebruikt de probabilistische-methode om cellen in één kamer te koppelen. Het kan echter alleen de koppeling van twee verschillende celtypen bereiken vanwege geometrische beperkingen in de apparaatstructuur. Een ander verslag van Lee et al. demonstreerde een deterministische methode om enkelvoudige cellen vast te leggen en te koppelen12. Dit apparaat verhoogt de koppel efficiëntie door de deterministische methode, maar het wordt beperkt door de verlengde bewerkingstijd die nodig is om cellen te koppelen. Specifiek, de tweede cel Capture kan alleen worden uitgevoerd nadat de eerste vastgelegde cel is bevestigd aan het oppervlak na 24 h. Zhao et al. rapporteerde een op droplet gebaseerd microfluïdisch apparaat om twee typen van één cel13vast te leggen. We kunnen vinden dat het op druppel gebaseerde microfluïdische apparaat nog steeds beperkt is tot de Poisson-verdeling en alleen kan worden gebruikt op niet-aangehechte cellen, en het is niet mogelijk om de cultuur oplossing tijdens het teeltproces te veranderen.
Eerder hebben we een microfluïdische “hydrodynamische pendelen chip” ontwikkeld die deterministische hydrodynamische krachten gebruikt om meerdere soorten eencellige in de cultuur kamer vast te leggen en vervolgens celco-cultuur experiment kan uitvoeren om te analyseren individuele Celmigratie gedrag onder celcelinteracties14. De hydrodynamische pendelen chip bestaat uit een reeks eenheden die elk een serpentine by-pass kanaal, een Capture-site en een cultuur kamer bevat. Door gebruik te maken van het verschil in stromingsweerstand tussen het serpentine by-pass kanaal en de kweekkamer, en een speciaal ontworpen operatie procedure, kunnen verschillende soorten enkelvoudige cellen herhaaldelijk in de kweekkamer worden gevangen. Met name de ruime ruimte van de cultuur kamer kan niet alleen voorkomen dat de cel wordt gespoeld tijdens het vastleggen van de cel, maar biedt ook voldoende ruimte voor de cellen om te verspreiden, te vermenigvuldigen en te migreren, waardoor het observeren van Live eencellige interacties mogelijk is. In dit artikel richten we ons op de productie van dit apparaat en gedetailleerde protocol stappen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De intercellulaire interacties van verschillende cellen in de tumor micro omgeving spelen een belangrijke rol in de progressie van de tumor17. Om het mechanisme van celcelinteracties te begrijpen, worden co-cultuur systemen gebruikt als een gemeenschappelijke analytische methode. Echter, meerdere celtypen en de heterogeniteit van de cellen zelf hebben geleid tot experimentele complexiteit en analytische moeilijkheden.
De hydrodynamische pendelen chip laat meerdere eence…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie van het ministerie van Wetenschappen en technologie (105-2628-E-400-001-MY2), en het Ph.D. programma in weefsel engineering en regeneratieve geneeskunde, nationale Chung Hsing University en National Health Research instituten.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
