Stabilire coculture basate su una singola cellula in modo deterministico con un chip microfluidico
Summary
Questo rapporto descrive un metodo microfluidico basato su chip per impostare un esperimento di coltura a cella singola in cui è possibile ottenere l’abbinamento ad alta efficienza e l’analisi microscopica di più cellule singole.
Abstract
I saggi di cocoltura cellulare sono stati ampiamente utilizzati per studiare le interazioni cellula-cellula tra diversi tipi di cellule per comprendere meglio la biologia delle malattie tra cui il cancro. Tuttavia, è difficile chiarire il complesso meccanismo delle interazioni intercellulari in popolazioni cellulari altamente eterogenee che utilizzano sistemi di cocoltura convenzionali perché l’eterogeneità della sottopopolazione cellulare è oscurata dai valori medi; i sistemi di cocoltura convenzionali possono essere utilizzati solo per descrivere il segnale della popolazione, ma non sono in grado di monitorare il comportamento delle singole cellule. Inoltre, i metodi sperimentali convenzionali a cella singola hanno una bassa efficienza nella manipolazione cellulare a causa della distribuzione di Poisson. I dispositivi microfabbricati sono una tecnologia emergente per gli studi a cella singola perché possono manipolare con precisione singole cellule ad alta produttività e possono ridurre il consumo di campioni e reagenti. Qui, descriviamo il concetto e l’applicazione di un chip microfluidico per più cocolture unicellulari. Il chip è in grado di catturare in modo efficiente più tipi di singole cellule in una camera di coltura (46%) e dispone di uno spazio di coltura sufficiente utile per studiare il comportamento delle cellule (ad esempio, migrazione, proliferazione, ecc.) sotto l’interazione cellula-cellula a livello di cellula singola. Le cellule endotiliche linfotiche e il carcinoma a cellule squamose orali sono stati utilizzati per eseguire un esperimento di cocoltura a cellule singole sulla piattaforma microfluidica per studi di interazione tra le singole imcellere dal vivo.
Introduction
L’acquisizione efficiente di diversi tipi di celle singole e la fornitura di spazio di coltura sufficiente sono necessari per esperimenti di cocoltura a cella singola di più tipi di celle singole1. Limitare la diluizione è il metodo più comunemente usato per preparare le singole cellule per tali esperimenti, a causa del basso costo delle attrezzature necessarie. Tuttavia, a causa della limitazione della distribuzione di Poisson, la probabilità massima di acquisizione di una singola cellula è solo del 37%, rendendo l’operazione sperimentale laboriosa e dispendiosa in termini di tempo2. Al contrario, l’utilizzo dello smistamento delle celle attivate a fluorescenza (FACS) può superare la limitazione della distribuzione di Poisson per preparare in modo elevato le singole celle3. Tuttavia, FACS potrebbe non essere accessibile ad alcuni laboratori a causa di costosi costi di strumentazione e manutenzione. I dispositivi microfabbricati sono stati recentemente sviluppati per l’intrappolamento a cella singoladi 4, l’abbinamento a cella singola5e le applicazioni di coltura a cella singola. Questi dispositivi sono vantaggiosi in base alla loro capacità di manipolare con precisione singole celle6, eseguire esperimenti ad alto rendimento o ridurre il consumo di campioni e reagenti. Tuttavia, l’esecuzione di esperimenti di cocoltura a cella singola con più tipi di cellule con gli attuali dispositivi microfluidici è ancora difficile a causa della limitazione della distribuzione di Poisson1,7,8, o l’incapacità di i dispositivi per catturare più di due tipi di celle singole4,5,6,9,10.
Per esempio, Yoon et al. ha segnalato un dispositivo microfluidico per lo studio di interazione cellulare-cellula11. Questo dispositivo utilizza il metodo probabilistico per accoppiare le celle in una camera. Tuttavia, può ottenere solo l’associazione di due diversi tipi di cella a causa di restrizioni geometriche nella struttura del dispositivo. Un altro rapporto di Lee et al. ha dimostrato un metodo deterministico per catturare e accoppiare singole celle12. Questo dispositivo aumenta l’efficienza di accoppiamento con il metodo deterministico, ma è limitato dal tempo di funzionamento prolungato richiesto per accoppiare le celle. In particolare, l’acquisizione della seconda cella può essere eseguita solo dopo che la prima cella catturata è stata attaccata alla superficie dopo che24 h. Possiamo riscontrare che il dispositivo microfluidico a base di gocciolamento è ancora limitato alla distribuzione di Poisson e può essere utilizzato solo su cellule non collegate, e non è possibile modificare la soluzione di coltura durante il processo di coltivazione.
In precedenza, abbiamo sviluppato un “chip di chiusura idrodinamico” microfluidico che utilizza forze idrodinamiche deterministiche per catturare più tipi di cellule singole nella camera di coltura e successivamente può eseguire esperimenti di cocoltura cellulare per analizzare comportamento di migrazione delle singole cellule nelle interazioni cellula-cellula14. Il chip di chiusura idrodinamico comprende un array di unità che contengono ciascuno un canale di passaggio serpentino, un sito di cattura e una camera di coltura. Utilizzando la differenza di resistenza al flusso tra il canale di passaggio serpentino e la camera di coltura, e una procedura operativa appositamente progettata, diversi tipi di singole cellule possono essere ripetutamente catturati nella camera di coltura. In particolare, l’ampio spazio della camera di coltura può non solo impedire che la cellula venga arrossata durante la cattura delle cellule, ma anche fornire spazio sufficiente per le cellule per diffondersi, proliferare e migrare, consentendo l’osservazione di interazioni vive a singola cellula. In questo articolo, ci concentriamo sulla produzione di questo dispositivo e passaggi di protocollo dettagliati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le interazioni intercellulari di varie cellule nel microambiente tumorale svolgono un ruolo importante nella progressione del tumore17. Per comprendere il meccanismo delle interazioni cellula-cellula, i sistemi di cocoltura vengono utilizzati come metodo analitico comune. Tuttavia, più tipi di cellule e l’eterogeneità delle cellule stesse hanno portato a complessità sperimentale e difficoltà analitiche.
Il chip di chiusura idrodinamico consente il caricamento di pi?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione del Ministero della Scienza e della Tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e dal Ph.D. Program in Ingegneria dei Tessuti e Medicina Rigenerativa, dalla National Chung Hsing University e dagli Istituti nazionali di ricerca sulla salute.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
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