Estabelecendo co-culturas baseadas em uma única célula de forma determinística com um chip Microfluídico
Summary
Este relatório descreve um método chip-baseado microfluídicos para estabelecer uma única experiência da cultura da pilha em que o emparelhamento de alta eficiência e a análise microscópica de pilhas únicas múltiplas podem ser conseguidos.
Abstract
Os ensaios de cocultura celular têm sido amplamente utilizados para estudar as interações célula-célula entre diferentes tipos de células para entender melhor a biologia das doenças, incluindo o câncer. No entanto, é desafiador esclarecer o complexo mecanismo de interações intercelulares em populações de células altamente heterogêneas usando sistemas de cocultura convencionais, pois a heterogeneidade da subpopulação celular é obscurecida pelos valores médios; os sistemas convencionais da cocultura podem somente ser usados para descrever o sinal da população, mas são incapazes de controlar o comportamento individual das pilhas. Além disso, os métodos experimentais convencionais de célula única têm baixa eficiência na manipulação celular por causa da distribuição de Poisson. Os dispositivos microfabricados são uma tecnologia emergente para estudos de célula única porque eles podem manipular com precisão células individuais em alta taxa de transferência e podem reduzir o consumo de amostras e reagentes. Aqui, nós descrevemos o conceito e a aplicação de uma microplaqueta microfluídicos para coculturas da único-pilha múltipla. A microplaqueta pode eficientemente capturar tipos múltiplos de únicas pilhas em uma câmara da cultura (~ 46%) e tem um espaço de cultura suficiente útil para estudar o comportamento das células (por exemplo, migração, proliferação, etc.) interação célula-célula no nível de célula única. As pilhas endothelial linfáticas e a carcinoma de pilha Squamous oral foram usadas para executar um experimento da cocultura da único-pilha na plataforma microfluídicos para estudos múltiplos vivos da interação da único-pilha.
Introduction
A captura eficiente de diferentes tipos de células individuais e o fornecimento de espaço de cultura suficiente são necessários para experimentos de cocultura de célula única de vários tipos de células individuais1. A diluição limitante é o método mais comumente utilizado para preparar as células individuais para tais experimentos, devido ao baixo custo do equipamento necessário. No entanto, devido à limitação da distribuição de Poisson, a probabilidade máxima de aquisição de célula única é de apenas 37%, tornando a operação experimental trabalhosa e demorada2. Por outro lado, usar a triagem de células ativadas por fluorescência (FACS) pode superar a limitação de distribuição de Poisson para preparar as células únicas3de alta eficiência. No entanto, o FACS pode não estar acessível a alguns laboratórios devido à dispendiosa instrumentação e custo de manutenção. Os dispositivos microfabricados foram desenvolvidos recentemente para a única pilha que interceptação4, única pilha que emparelha5, e únicas aplicações da cultura da pilha. Esses dispositivos são vantajosos com base em sua capacidade de manipular com precisão as células únicas6, realizar experimentos de alta taxa de transferência ou reduzir o consumo de amostras e reagentes. No entanto, realizar experimentos de cocultura de célula única com vários tipos de células com os atuais dispositivos microfluílicos ainda é desafiador devido à limitação da distribuição de Poisson1,7,8ou incapacidade de os dispositivos para capturar mais de dois tipos de células individuais4,5,6,9,10.
Por exemplo, Yoon et al. relataram um dispositivo microfluídico para o estudo de interação célula-célula11. Este dispositivo usa o método probabilístico para emparelhar as células em uma câmara. No entanto, ele só pode alcançar o emparelhamento de dois tipos de células diferentes devido a restrições geométricas na estrutura do dispositivo. Outro relato de Lee et al. demonstrou um método determinístico para capturar e emparelhar células individuais12. Este dispositivo é aumenta a eficiência de emparelhamento pelo método determinístico mas é limitado pelo tempo prolongado da operação exigido para emparelhar pilhas. Especificamente, a segunda captura de célula só pode ser realizada depois que a primeira célula capturada é anexada à superfície após 24 h. Zhao et al. relataram um dispositivo microfluídico baseado em gotas para capturar dois tipos de uma única célula13. Podemos encontrar que o dispositivo microfluídico baseado em gotas ainda está limitado à distribuição de Poisson e só pode ser usado em células não anexadas, e não é possível alterar a solução de cultura durante o processo de cultivo.
Anteriormente, desenvolvemos um microfluídico “chip de shuttling hidrodinâmico” que utiliza forças hidrodinâmicas determinísticas para capturar vários tipos de célula única na câmara de cultura e pode subsequentemente realizar experimento de cocultura celular para analisar comportamento de migração de células individuais em interações Cell-Cell14. O chip de shuttling hidrodinâmico compreende um conjunto de unidades vestiu que cada um contém um canal de passagem por serpentina, um local de captura e uma câmara de cultura. Usando a diferença na resistência do fluxo entre a canaleta serpentina do by-pass e a câmara da cultura, e um procedimento especialmente projetado da operação, os tipos diferentes de únicas pilhas podem repetidamente ser capturados na câmara da cultura. Notavelmente, o amplo espaço da câmara de cultura não só pode impedir que a célula seja lavada durante a captura de células, mas também fornecer espaço suficiente para as células se espalham, proliferam e migram, permitindo a observação de interações de células únicas ao vivo. Neste artigo, nós nos concentramos na produção deste dispositivo e etapas detalhadas do protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
As interações intercelular de várias pilhas no microambiente do tumor jogam um papel importante na progressão do tumor17. A fim compreender o mecanismo de interações da pilha-pilha, os sistemas da cocultura são usados como um método analítico comum. Entretanto, os tipos múltiplos da pilha e a heterogeneidade das pilhas elas mesmas conduziram à complexidade experimental e às dificuldades analíticas.
O chip de shuttling hidrodinâmico permite o carregamento m…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Ministério da ciência e tecnologia (105-2628-E-400-001-MY2), e o programa de doutorado em engenharia de tecidos e medicina regenerativa, Universidade Nacional Chung Hsing e institutos nacionais de pesquisa em saúde.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
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