Создание одноклеточных сокультур в детерминированном манусе с микрофлюидным чипом
Summary
В этом докладе описывается микрофлюидный чип-метод для создания эксперимента на одной культуре клеток, в котором может быть достигнут высокоэффективный спаривание и микроскопический анализ нескольких одиночных клеток.
Abstract
Клеточная ко-культура анализы были широко использованы для изучения клеточных взаимодействий между различными типами клеток, чтобы лучше понять биологию заболеваний, включая рак. Однако прояснить сложный механизм межклеточного взаимодействия в высокоразногенных популяциях клеток с помощью обычных систем совместной культуры сложно, поскольку неоднородность клеточной субпопуляции затушевывается средними значениями; обычные системы совместной культуры могут использоваться только для описания сигнала популяции, но неспособны отслеживать поведение отдельных клеток. Кроме того, обычные одноклеточные экспериментальные методы имеют низкую эффективность в манипуляции ячейками из-за распределения Пуассона. Микрофабрикаты устройства являются новой технологией для одноклеточных исследований, потому что они могут точно манипулировать одиночными клетками с высокой пропускной мощностью и могут уменьшить потребление образцов и реагентов. Здесь мы описываем концепцию и применение микрофлюидного чипа для нескольких одноклеточных кокультур. Чип может эффективно захватывать несколько типов одиночных ячеек в культурной камере (46%) и имеет достаточное пространство культуры, полезное для изучения поведения клеток (например, миграция, пролиферация и т.д.) при взаимодействии клеток на одноклеточном уровне. Лимфатические эндотелиальные клетки и оральные плоскоклеточные карциномы были использованы для выполнения одноклеточного эксперимента совместной культуры на микрофлюидной платформе для живых нескольких одноклеточных исследований взаимодействия.
Introduction
Эффективный захват различных типов одиночных ячеек и обеспечение достаточного пространства культуры необходимы для экспериментов одноклеточной совместной культуры нескольких типов одиночных ячеек1. Ограничение разбавления является наиболее часто используемым методом подготовки одиночных ячеек для таких экспериментов, из-за низкой стоимости необходимого оборудования. Однако, из-за ограничения распределения Poisson, максимальная вероятность приобретения одной ячейки составляет всего 37%, что делает экспериментальную операцию трудоемкой и трудоемкой2. В отличие от этого, с помощью флуоресценции активированной сортировки клеток (FACS) может преодолеть ограничение распределения Пуассона для высокоэффективной подготовки одиночных ячеек3. Однако FACS может быть недоступен для некоторых лабораторий из-за дорогостоящих затрат на оборудование и техническое обслуживание. Микрофабрикаты устройства были недавно разработаны для одной ячейки захвата4, одноклеточных сопряжения5, и одноклеточных приложений культуры. Эти устройства являются выгодными на основе их способности точно манипулировать одиночными ячейками6,выполнять высокопроизводительные эксперименты, или уменьшить потребление образцов и реагентов. Тем не менее, выполнение одноклеточных экспериментов совместной культуры с несколькими типами клеток с текущими микрофлюидными устройствами по-прежнему является сложной задачей из-за ограничения распределения Пуассон1,7,8, или неспособность устройства для захвата более двух типов одиночных ячеек4,5,6,9,10.
Например, Yoon et al. сообщили о микрофлюидном устройстве для исследования взаимодействия клеток11. Это устройство использует вероятностный метод для сопряжения ячеек в одной камере. Тем не менее, он может достичь только сопряжения двух различных типов клеток из-за геометрических ограничений в структуре устройства. Другой доклад От Ли и др. продемонстрировали детерминированный метод захвата и сопряжения одиночных ячеек12. Это устройство повышает эффективность сопряжения с помощью детерминированного метода, но оно ограничено длительным временем работы, требуемым для сопряжения клеток. В частности, второй захват ячейки может быть выполнен только после того, как первая захваченная ячейка прикреплена к поверхности после 24 ч. Чжао и др. сообщили о микрофлепированном устройстве на основе капель для захвата двух типов одной ячейки13. Мы можем обнаружить, что микрофлюидное устройство на основе капель по-прежнему ограничено распределением Пуассона и может использоваться только на неподключенных клетках, и изменить культурное решение в процессе выращивания невозможно.
Ранее мы разработали микрофлюидный “гидродинамический челночный чип”, который использует детерминированные гидродинамические силы для захвата нескольких типов одноклеточных в камеру культуры и может впоследствии выполнять эксперимент клеточной кокультуры для анализа поведение миграции отдельных клеток при взаимодействии клеток14. Гидродинамический челночный чип состоит из массивных наборов юнитов, каждый из которых содержит серпантинный объездной канал, место захвата и культурную камеру. Используя разницу в сопротивлении потока между серпантинным объездным каналом и культурной камерой, и специально разработанную процедуру работы, различные типы одиночных ячеек могут быть повторно захвачены в камеру культуры. Примечательно, что достаточное пространство камеры культуры может не только предотвратить промывку клетки во время захвата клеток, но и обеспечить достаточное пространство для клеток, чтобы распространяться, размножаться и мигрировать, что позволяет наблюдать живые одноклеточные взаимодействия. В этой статье мы сосредоточимся на производстве этого устройства и подробных протокольных шагах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Межклеточные взаимодействия различных клеток в микроокружении опухоли играют важную роль в прогрессировании опухоли17. Для того, чтобы понять механизм взаимодействия клеток, системы сокультуры используются в качестве общего аналитического метода. Однако несколько типов…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана грантом Министерства науки и техники (105-2628-E-400-001-MY2), а также докторской программой в области тканевой инженерии и регенеративной медицины, Национальным университетом Чунг-Синг и Национальными научно-исследовательскими институтами здравоохранения.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
