Skapa encellig Co-kulturer på ett deterministiskt sätt med ett Microfluidic chip
Summary
Denna rapport beskriver en mikroflödessystem chip-baserad metod för att ställa in ett enda cellkultur experiment där högeffektiv hopkoppling och mikroskopisk analys av flera enskilda celler kan uppnås.
Abstract
Cell Co-Culture analyser har använts i stor utsträckning för att studera cell-cell interaktioner mellan olika celltyper för att bättre förstå biologi av sjukdomar inklusive cancer. Det är dock utmanande att klargöra den komplexa mekanismen för intercellulära interaktioner i mycket heterogena cellpopulationer med hjälp av konventionella Co-Culture system eftersom heterogenitet av cell subpopulationen är skyms av medelvärdena; de konventionella Co-Culture-systemen kan endast användas för att beskriva befolknings signalen, men är oförmögna att spåra enskilda cellers beteende. Konventionella encellig experimentella metoder har dessutom låg verkningsgrad vid cell manipulation på grund av Poissonfördelningen. Mikrofabricerade enheter är en framväxande teknik för encelliga studier eftersom de kan noggrant manipulera enskilda celler vid hög genomströmning och kan minska prov och reagensförbrukning. Här beskriver vi konceptet och tillämpningen av en mikroflödessystem chip för flera encellig Co-kulturer. Chippet kan effektivt fånga flera typer av enstaka celler i en kultur kammare (~ 46%) och har en tillräcklig kultur utrymme användbar för att studera cellernas beteende (t. ex. migration, proliferation, etc.) under cell-cell interaktion på encellig nivå. Lymfatiska endotelceller och Oral skivepitelcancer användes för att utföra en encellig Co-Culture experiment på mikroflödessystem plattform för levande flera encellig interaktionsstudier.
Introduction
Effektiv avskiljning av olika typer av enskilda celler och ge tillräckligt kultur utrymme behövs för Single cell Co-kultur experiment av flera typer av enskilda celler1. Begränsande utspädning är den vanligaste metoden för att förbereda de enskilda cellerna för sådana experiment, på grund av den låga kostnaden för utrustning som krävs. Men på grund av Poissonfördelningsbegränsande, är den maximala sannolikheten för enstaka cell förvärv endast 37%, vilket gör försöks operationen mödosam och tidskrävande2. Med fluorescensaktiverad cell sortering (FACS) kan man däremot övervinna Poissondistributionsbegränsande funktionen för att på ett effektivt sätt förbereda enstaka celler3. Men FACS kanske inte är tillgängliga för vissa laboratorier på grund av dyra instrumentering och underhållskostnader. Mikrofabricerade enheter har nyligen utvecklats för Single cell svällning4, Single cell parkoppling5, och Single cellkultur applikationer. Dessa enheter är fördelaktiga baserat på deras förmåga att korrekt manipulera enskilda celler6, utföra hög genomströmning experiment, eller minska prov och reagensförbrukning. Men att utföra encellig Co-Culture experiment med flera celltyper med nuvarande mikroflödessystem enheter är fortfarande utmanande på grund av begränsningen av Poisson fördelning1,7,8, eller oförmåga enheterna att fånga mer än två typer av enskilda celler4,5,6,9,10.
Till exempel rapporterade Yoon et al. en mikroflödessystem enhet för cell-cell interaktion studie11. Den här enheten använder den probabilistiska metoden för att para ihop celler i en kammare. Det kan dock bara uppnå hopkopplingen av två olika celltyper på grund av geometriska begränsningar i enhets strukturen. En annan rapport från Lee et al. demonstrerade en deterministisk metod för att fånga och para ihop enstaka celler12. Den här enheten ökar parnings effektiviteten med den deterministiska metoden men begränsas av den förlängda drifttid som krävs för att para ihop celler. Specifikt kan den andra cell fångsten endast utföras efter att den första fångade cellen är kopplad till ytan efter 24 h. Zhao et al. rapporterade en droplet-baserad mikroflödessystem-enhet för att fånga två typer av en enda cell13. Vi kan grunda att den droplet-baserade mikroflödessystem-enheten fortfarande är begränsad till poissonfördelningen och kan endast användas på icke-anslutna celler, och det är inte möjligt att ändra kultur lösningen under odlingsprocessen.
Tidigare har vi utvecklat en mikroflödessystem “hydrodynamiska shuttling chip” som utnyttjar deterministiska hydrodynamiska krafter för att fånga flera typer av Single-cell i kultur kammaren och kan därefter utföra cell Co-Culture experiment för att analysera individuell cell migration beteende under cell-cell interaktioner14. Det hydrodynamiska shuttling-chippet består av en klädd uppsättning enheter som var och en innehåller en Serpentine by-pass-kanal, en insamlingsplats och en kultur kammare. Genom att använda skillnaden i flödesmotstånd mellan Serpentine by-pass-kanalen och kultur kammaren, och en särskilt utformad drift procedur, kan olika typer av enstaka celler upprepade gånger fångas in i kultur kammaren. I synnerhet kan det rikliga utrymmet i kultur kammaren inte bara hindra cellen från att spolas under cell fångst ut utan också ge tillräckligt med utrymme för cellerna att sprida, förgöra och migrera, vilket möjliggör observation av levande Single-cell interaktioner. I den här artikeln fokuserar vi på produktionen av den här enheten och detaljerade protokoll steg.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intercellulära interaktioner mellan olika celler i tumören mikromiljö spela en viktig roll i utvecklingen av tumören17. För att förstå mekanismen för cellcellsinteraktioner används samkultursystem som en gemensam analysmetod. Men, flera celltyper och heterogenitet av cellerna själva har lett till experimentell komplexitet och analytiska svårigheter.
Det hydrodynamiska shuttling-chippet möjliggör flera encellslastning i kultur kammaren med en determinist…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från ministeriet för vetenskap och teknik (105-2628-E-400-001-MY2 nätters), och doktorsexamen program inom vävnadsteknik och regenerativ medicin, National Chung Hsing University och nationella hälso forskningsinstitut.
Materials
| 3M Advanced Polyolefin Diagnostic Microfluidic Medical Tape | 3M Company | 9795R | |
| Antibiotics | Biowest | L0014-100 | Glutamine-Penicillin-Streptomycin |
| AutoCAD software | Autodesk | AutoCAD LT 2011 | Part No. 057C1-74A111-1001 |
| CellTracke Blue CMAC Dye | Invitrogen | C2110 | |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Invitrogen | C7025 | |
| Conventional oven | YEONG-SHIN company | ovp45 | |
| Desiccator | Bel-Art Products | F42020-0000 | Space saver vacuum desiccator 190 mm white base |
| DiIC12(3) cell membrane dye | BD Biosciences | 354218 | Used as a cell tracker |
| DMEM-F12 medium | Gibco | 11320-082 | |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | PromoCell | C-22022 | |
| Fetal bovine serum Hyclone | Thermo | SH30071.03HI | |
| Hamilton 700 series Glass syringe ( 0.1 ml ) | Hamilton | 80630 | 100 µL, Model 710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 2 |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15075 | with 1.5mm inner-diameter |
| Harris Uni-Core puncher | Ted Pella Inc. | 15071 | with 0.5mm inner-diameter |
| Hotplate | YOTEC company | YS-300S | |
| Msak aligner | Deya Optronic CO. | A1K-5-MDA | |
| Oxygen plasma | NORDSON MARCH | AP-300 | |
| Plasma cleaner | Nordson | AP-300 | Bench-Top Plasma Treatment System |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) kit | Dow corning | Sylgard 184 | |
| Poly-tetrafluoroethene (PTFE) | Ever Sharp Technology, Inc. | TFT-23T | inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm |
| Removable tape | 3M Company | Scotch Removable Tape 811 | |
| Silicon wafer | Eltech corperation | SPE0039 | |
| Spin coater | Synrex Co., Ltd. | SC-HMI 2" ~ 6" | |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | Leica E24 | |
| SU-8 10 negative photoresist | MicroChem | Y131259 | |
| SU-8 2 negative photoresist | MicroChem | Y131240 | |
| SU-8 2050 negative photoresist | MicroChem | Y111072 | |
| SU-8 developer | Grand Chemical Companies | GP5002-000000-72GC | Propylene glycol monomethyl ether acetate |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | 703007 | |
| Trichlorosilane | Gelest, Inc | SIT8174.0 | Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water. |
| Trypsin Neutralizer Solution | Gibco | R-002-100 |
References
- Goers, L., Freemont, P., Polizzi, K. M. Co-culture systems and technologies: taking synthetic biology to the next level. Journal of the Royal Society, Interface. 11 (96), 20140065 (2014).
- Collins, D. J., Neild, A., deMello, A., Liu, A. Q., Ai, Y. The Poisson distribution and beyond: methods for microfluidic droplet production and single cell encapsulation. Lab on a Chip. 15 (17), 3439-3459 (2015).
- Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. Generation of a prostate from a single adult stem cell. Nature. 456, 804 (2008).
- Roman, G. T., Chen, Y., Viberg, P., Culbertson, A. H., Culbertson, C. T. Single-cell manipulation and analysis using microfluidic devices. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 387 (1), 9-12 (2007).
- Frimat, J. P., et al. A microfluidic array with cellular valving for single cell co-culture. Lab on a Chip. 11 (2), 231-237 (2011).
- Rettig, J. R., Folch, A. Large-Scale Single-Cell Trapping And Imaging Using Microwell Arrays. Analytical Chemistry. 77 (17), 5628-5634 (2005).
- Gracz, A. D., et al. A high-throughput platform for stem cell niche co-cultures and downstream gene expression analysis. Nature Cell Biology. 17 (3), 340 (2015).
- Tumarkin, E., et al. High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics. Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).
- Hong, S., Pan, Q., Lee, L. P. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Chung, M. T., Núñez, D., Cai, D., Kurabayashi, K. Deterministic droplet-based co-encapsulation and pairing of microparticles via active sorting and downstream merging. Lab on a Chip. 17 (21), 3664-3671 (2017).
- Chen, Y. C., et al. Paired single cell co-culture microenvironments isolated by two-phase flow with continuous nutrient renewal. Lab on a Chip. 14 (16), 2941-2947 (2014).
- Hong, S., Lee, L. P., Pan, Q. Single-cell level co-culture platform for intercellular communication. Integrative Biology. 4 (4), 374-380 (2012).
- Segaliny, A. I., et al. Functional TCR T cell screening using single-cell droplet microfluidics. Lab on a Chip. 18 (24), 3733-3749 (2018).
- He, C. K., Chen, Y. W., Wang, S. H., Hsu, C. H. Hydrodynamic shuttling for deterministic high-efficiency multiple single-cell capture in a microfluidic chip. Lab on a Chip. 19 (8), 1370-1377 (2019).
- Wang, S. H., et al. Tumour cell-derived WNT5B modulates in vitro lymphangiogenesis via induction of partial endothelial-mesenchymal transition of lymphatic endothelial cells. Oncogene. 36, 1503 (2016).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Current Protocols in Immunology. 111 (1), A3.B.1-A3.B.3 (2015).
- Kim, J. B., Stein, R., O’hare, M. J. Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-a review. Breast Cancer Research and Treatment. 85 (3), 281-291 (2004).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Wu, M. H., Huang, S. B., Lee, G. B. Microfluidic cell culture systems for drug research. Lab on a Chip. 10 (8), 939-956 (2010).
- Hong, J. W., Song, S., Shin, J. H. A novel microfluidic co-culture system for investigation of bacterial cancer targeting. Lab on a Chip. 13 (15), 3033-3040 (2013).
