체미애 남성 액세서리 땀샘의 이차 세포에서 RNA를 분리하는 FACS 기반 프로토콜
Summary
여기에서, 우리는 RNA 염기서열 분석 및 RT-qPCR를 위한 Drosophila 남성 부속부전 (이차 세포)에서 특정 세포 집단을 해리하고 분류하는 프로토콜을 제시합니다. 세포 분리는 해부, 프로테아제 소화 및 기계적 분산을 요구하는 다단계 해리 과정 후 GFP 발현 이차 세포의 FACS 정제를 통해 달성된다.
Abstract
기관의 기능을 이해하려면 종종 구성 세포 집단의 역할을 이해하는 것이 유용합니다. 불행히도, 개별 적인 세포 인구의 희미함은 수시로 분자 연구 결과를 위한 충분한 물자를 얻기 위하여 어렵게 만듭니다. 예를 들어, Drosophila 남성 생식 시스템의 부속동맥에는 두 가지 뚜렷한 분비 세포 유형이 포함되어 있습니다. 주요 세포는 선의 분비 세포의 96 %를 구성하고, 보조 세포 (SC)는 세포의 나머지 4 %를 구성하는 동안 (남성 당 약 80 세포). 두 세포 모형이 정액 액체의 중요한 분대를 생성하더라도, 단지 몇몇 유전자는 SCs에 특정하기 위하여 알려집니다. SCs의 희소성은, 지금까지, 이 중요한 세포 모형의 전사성 분석 연구 결과 방해했습니다. 여기서, RNA 추출 및 시퀀싱을 위한 SC의 정제를 허용하는 방법이 제시된다. 프로토콜은 SC 특정 GFP 리포터를 표현하는 파리에서 먼저 땀샘을 해부한 다음 개별 세포를 얻기 위해 프로테아제 소화 및 기계적 해리를 이 땀샘을 복종시키는 것으로 구성됩니다. 이러한 단계에 따라, 개별, 살아있는, GFP 표시 세포는 RNA 정제를 위한 형광 활성화 세포 선별기 (FACS)를 사용하여 분류된다. 이 절차는 다운스트림 RT-qPCR 및/또는 RNA 시퀀싱을 위한 조건당 ~40남성으로부터 SC 특이적 RNA를 하루 동안 산출합니다. 절차의 신속성과 단순성은 다른 유전자형 또는 환경 조건에서 많은 다른 파리의 전사체가 단기간에 결정될 수 있게 합니다.
Introduction
기관은 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 각각 은산 기능을 가지고 있으며 때로는 매우 다른 유전자 세트를 발현합니다. 기관이 어떻게 기능하는지 에 대한 정확한 이해를 얻으려면 이 기관을 구성하는 각 별개의 세포 유형을 연구하는 것이 종종 중요합니다. 가능한 기능을 탐구하는 데 사용되는 주요 방법 중 하나는 전사체 분석입니다. 이 강력한 방법은 활성 프로세스 및 경로를 밝히기 위해 세포에서 유전자 발현의 스냅 샷을 제공합니다. 그러나, 분석의 이 모형은 수시로 훨씬 더 풍부한 이웃 세포에서 정제되어야 하는 희소한 세포 인구를 위해 어렵습니다. 예를 들면, Drosophila 남성 부속동맥은 2개의 분비 세포 모형의 1 차적으로 위로 위로 한 기관입니다. 2개의 세포 모형의 희소한 이 선의 세포의 단지 4%를 포함하는 것과 같이, 세포 모형 특정 전사체 분석의 사용은 이 세포의 기능을 결정하는 것을 돕기 위하여 이용되지 않았습니다.
부속동맥(AGs)은 곤충의 남성 생식기관의 기관입니다. 그(것)들은 정액 액체의 단백질의 대부분의 생산에 책임 있습니다 (정액 액체 단백질 (SFPs) 및 부속 동맥 단백질 (Acps)). 이들 SFPs 중 일부는 짝짓기 후 반응(PMR)이라고 불리는 짝짓기 여성의 생리적 및 행동 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. PMR의 일부는 다음을 포함: 증가 배란 및 계란 누워 속도, 저장 및 정자의 릴리스, 여성 다이어트의 변화, 그리고 보조 구애 남성에 여성 수용성의 감소1,2. 곤충이 인간의 건강(치명적인 질병의 벡터)에서 농업(곤충은 해충일 수 있지만 수분 및 토양 품질에 매우 중요함)에 이르기까지 많은 주요 사회 문제에 영향을 미치기 때문에 곤충 번식을 이해하는 것은 중요한 연구 분야입니다. AGs 및 APS의 연구는 모델 유기체 인 Drosophila melanogaster로 상당히 진행되었습니다. 이러한 연구는 AGS와 그들이 PMR을 만드는 과정에서 생산하는 개별 단백질의 일부의 역할을 강조, 질병 벡터 Aedes aegypti같은 다른 종에서 작업에 영향을 미치는3,4,및 기타 곤충1 ,5. 더욱이, AGs가정액액1,6의 성분을 분비함에 따라 그들은 종종 포유류 전립선 및 정액 소포의 기능적 유사체로 생각된다. 이 기능 유사성은 두 조직 유형 사이의 분자 유사성과 결합되어, AGs를 파리7에서전립선에 대한 모델로 만들었습니다.
Drosophila 수컷 안에는, 부속 동맥의 2개의 엽이 있습니다. 각 로브는 중앙 루멘을 둘러싸는 분비 세포의 단층으로 구성되고 평활근으로 감싸는 주머니 와 같은 구조로 볼 수 있습니다. 위에서 언급 한 바와 같이, 이 선을 구성하는 두 가지 형태학적으로, 발달및 기능적으로 뚜렷한 분비 세포 유형이 있습니다 : 다각형 모양의 주 세포 (세포의 ~ 96 %를 구성), 그리고 더 큰, 둥근 이차 세포 (SC)(를 구성 세포의 나머지 4%, 또는 로브 당 약 40 세포). 두 세포 유형 모두 PMR을 유도하고 유지하기 위해 뚜렷한 APS 세트를 생성하는 것으로 나타났습니다. 현재까지 얻어진 대부분의 데이터는 PMR의 특징적인 행동의 대부분을 트리거링하는 단 하나 단백질의 역할을 강조합니다. 이 단백질, 성 펩티드는, 주 세포8,9,10에의해 분비되는 작은, 36 아미노산 펩티드이다. 성 펩티드가 PMR에서 중요한 역할을 하는 것처럼 보이지만, 주 및 이차 세포 모두에 의해 생성된 다른 APS는 PMR11,12,13,14의 다양한 양상에 영향을 미치는 것으로 나타났습니다. ,15,16,17. 예를 들어, 우리의 현재 지식에 기초하여, SC는, 그들이 생산하는 단백질을 통해, 첫날18후 SP 신호의 영속을 위해 요구되는 것처럼 보입니다.
SC의 희미함을 감안할 때 (남성 당 단지 80 세포), 이 세포와 그(것)들이 생성하는 단백질에 관하여 우리의 모든 지식은 유전학과 후보 접근에서 옵니다. 지금까지, 유전자의 상대적으로 작은 목록만이 SC 특이적인 것으로 나타났다. 이 목록에는 동균 단백질 결함 입증(Dve)19,lncRNA MSA20, Rab6, 7, 11 및 1921, CG1656 및 CG17575 11, 15,21 및 동종상자 전사인 복부-B(Abd-B)18. 이전에는 이차 세포에서 Abd-B와 lncRNA MSA의 발현 모두에 대한 돌연변이결핍이 PMR의 길이를 ~10일에서 1일1일로 단축시키는 것으로 나타났습니다. , 18세 , 20. 이 표현형은 여성 생식 기관12,18,20에서SP의 부적절한 저장에 기인하는 것으로 보입니다. 세포 수준에서, 이 돌연변이의 이차 세포는 그들의 특징적인 환액 같이 구조물18,20,21를분실하는 이상한 형태를 보여줍니다. 이 돌연변이 선을 사용하여, 우리는 이전에 야생 모형 또는 돌연변이 부속 동맥12에서전체 AGs의 전사 단면도를 비교해서 SC 기능에 관련시킨 유전자를 확인하기 위하여 시도했습니다. 또한, 다른 실험실에서는 SC 수, 형태학 및 백신 함량이 남성 식단, 짝짓기 상태 및 연령21,25,26에따라 달라지는 것으로 나타났다.
이러한 접근법을 사용하여 긍정적인 진전이 이루어졌지만 전체 SC 전사체는 달성되지 않았습니다. 이 기관에 있는 이 세포의 희소성은 야생 모형 세포에서 조차 더 점진하는 것을 어렵게 했습니다. 유전자 발현을 테스트하기 위해, 특정 환경 자극 후이 세포의 변화는 더 어려울 것입니다. 따라서, 상이한 유전적 배경 및 환경 조건 하에서 수행하기에 충분히 빠르고 간단한 SC RNA를 분리하고 정화하는 방법이 필요하였다.
Abd-B 및 MSA 유전자 둘 다 SCs18,20에서그들의 발현을 위한 초파리 비트토락스 컴플렉스(D1 증강제라고 함)로부터 특이적인 1.1 kb 증강을 요구한다. 이 증강은 이전에 UAS-GFP와연관될 때 SC에서 특히 강력한 GFP 표현을 구동할 수 있는 GAL4 드라이버를 만드는 데 사용되었습니다. 따라서, 우리는 야생 형과 iab-6cocuD1 AGs 둘 다에서 이 세포를 격리하는 FACS 프로토콜을 위한 기초로 이 선을 이용했습니다. iab-6cocuD1 돌연변이 체가 다른 세포 형태를 표시함에 따라, 우리는 이 프로토콜이 매우 다른 조건하에서 이 희소한 세포 유형으로부터 그들의 전사체의 결정을 위해 세포를 분리하는 데 사용될 수 있음을 보여준다.
Protocol
Representative Results
Discussion
가상 디스크와 같은 초파리 조직에서 세포 해리를 위한 방법은 이미23에기재되어 있다. 단순히 액세서리 땀샘에 이러한 절차를 사용 하려는 우리의 시도 실패, 이 새로운 프로토콜을 개발 하는 우리를 격려. 프로테아제 소화와 기계적 삼각화는 시술의 성공을 위해 우리가 고민하는 중요한 단계였으며, 따라서 실험자가 만족스러운 결과를 얻을 수 있도록 섹션 2에서 5절에 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Karch 연구소의 구성원, iGE3 게놈 판형, 제네바 대학의 유동 세포 분석 핵심 시설, FACS 프로토콜을 설정한 장 피에르 오브리-라체인예 박사에게 감사드립니다. 우리는 IGV에 읽기를 시각화에 그의 도움 루카 Stickley 감사합니다. 우리는 인물을 재사용할 수 있는 부드러운 허락을 주신 것에 대해 감사드리며, 글을 쓰는 창의력을 발휘하라는 메시지를 전해주신 편집자분들께 감사드립니다.
이 연구는 제네바 주(CI, RKM, FK), 스위스 국립 연구 기금(www.snf.ch)과 클라라즈 재단(FK)의 기부금에 의해 지원되었습니다.
Materials
| 24-wells Tissue Culture plate | VWR | 734-2325 | |
| Binocular microscope for dissection | |||
| Binocular with light source for GFP | |||
| Bunsen | |||
| Draq7 0.3 mM | BioStatus | DR71000 | |
| Plastic microtubes 1.5 mL | Eppendorf | ||
| FACS | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | |
| Fine dissection forceps | |||
| Foetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | heat inactivated prior to use |
| Glass dishes for dissection | |||
| Ice bucket | |||
| ImProm-II Reverse Transcription System | Promega | A3800 | |
| MasterPure RNA Purification Kit | Epicentre | MCR85102 | |
| Nextera XT kit | illumina | https://emea.illumina.com/products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/nextera-xt-dna.html | |
| P1000 | Gilson | ||
| P20 | Gilson | ||
| P200 | Gilson | ||
| Papain | 50U/mL stock | ||
| PBS | home made | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | |
| PolydT primers | |||
| Random hexamer primers | |||
| RNA 6000 Pico kit | Agilent | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Gibco | 21720-001 | |
| SMARTer cDNA synthesis kit | Takara | https://www.takarabio.com/products/cdna-synthesis/cdna-synthesis-kits/smarter-cdna-synthesis-kits | |
| SYBR select Master mix for CFX | applied biosystems | 4472942 | |
| Thermo Shaker | Hangzhou Allsheng intruments | MS-100 | |
| Tipone 1250 μl graduated tip | Starlab | S1161-1820 | |
| Tipone 200 μl bevelled tip | Starlab | S1161-1800 | |
| TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604013 | |
| Vortex |
References
- Avila, F. W., Sirot, L. K., LaFlamme, B. A., Rubinstein, C. D., Wolfner, M. F. Insect seminal fluid proteins: identification and function. Annual Review of Entomology. 56, 21-40 (2011).
- Carmel, I., Tram, U., Heifetz, Y. Mating induces developmental changes in the insect female reproductive tract. Current Opinion in Insect Science. 13, 106-113 (2016).
- League, G. P., Baxter, L. L., Wolfner, M. F., Harrington, L. C. Male accessory gland molecules inhibit harmonic convergence in the mosquito Aedes aegypti. Current Biology. 29 (6), R196-R197 (2019).
- Degner, E. C., et al. Proteins, Transcripts, and Genetic Architecture of Seminal Fluid and Sperm in the Mosquito Aedes aegypti. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (Suppl 1), S6-S22 (2019).
- Wedell, N. Female receptivity in butterflies and moths. Journal of Experimental Biology. 208 (Pt 18), 3433-3440 (2005).
- Laflamme, B. A., Wolfner, M. F. Identification and function of proteolysis regulators in seminal fluid. Molecular Reproduction and Development. 80 (2), 80-101 (2013).
- Wilson, C., Leiblich, A., Goberdhan, D. C., Hamdy, F. The Drosophila Accessory Gland as a Model for Prostate Cancer and Other Pathologies. Current Topics in Developmental Biology. 121, 339-375 (2017).
- Kubli, E., Bopp, D. Sexual behavior: how Sex Peptide flips the postmating switch of female flies. Current Biology. 22 (13), R520-R522 (2012).
- Kubli, E. Sex-peptides: seminal peptides of the Drosophila male. Cellular and Molecular Life Sciences. 60 (8), 1689-1704 (2003).
- Liu, H., Kubli, E. Sex-peptide is the molecular basis of the sperm effect in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (17), 9929-9933 (2003).
- Ram, K. R., Wolfner, M. F. Sustained post-mating response in Drosophila melanogaster requires multiple seminal fluid proteins. PLoS Genetics. 3 (12), e238 (2007).
- Sitnik, J. L., Gligorov, D., Maeda, R. K., Karch, F., Wolfner, M. F. The Female Post-Mating Response Requires Genes Expressed in the Secondary Cells of the Male Accessory Gland in Drosophila melanogaster. Génétique. 202 (3), 1029-1041 (2016).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Acp36DE is required for uterine conformational changes in mated Drosophila females. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (37), 15796-15800 (2009).
- Adams, E. M., Wolfner, M. F. Seminal proteins but not sperm induce morphological changes in the Drosophila melanogaster female reproductive tract during sperm storage. Journal of Insect Physiology. 53 (4), 319-331 (2007).
- Singh, A., et al. Long-term interaction between Drosophila sperm and sex peptide is mediated by other seminal proteins that bind only transiently to sperm. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 102, 43-51 (2018).
- Avila, F. W., Wolfner, M. F. Cleavage of the Drosophila seminal protein Acp36DE in mated females enhances its sperm storage activity. Journal of Insect Physiology. 101, 66-72 (2017).
- Chapman, T., Davies, S. J. Functions and analysis of the seminal fluid proteins of male Drosophila melanogaster fruit flies. Peptides. 25 (9), 1477-1490 (2004).
- Gligorov, D., Sitnik, J. L., Maeda, R. K., Wolfner, M. F., Karch, F. A novel function for the Hox gene Abd-B in the male accessory gland regulates the long-term female post-mating response in Drosophila. PLoS Genetics. 9 (3), e1003395 (2013).
- Minami, R., et al. The homeodomain protein defective proventriculus is essential for male accessory gland development to enhance fecundity in Drosophila. PLoS One. 7 (3), e32302 (2012).
- Maeda, R. K., et al. The lncRNA male-specific abdominal plays a critical role in Drosophila accessory gland development and male fertility. PLoS Genetics. 14 (7), e1007519 (2018).
- Prince, E., et al. Rab-mediated trafficking in the secondary cells of Drosophila male accessory glands and its role in fecundity. Traffic. 20 (2), 137-151 (2019).
- Robinson, M. D., Oshlack, A. A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data. Genome Biology. 11 (3), R25 (2010).
- Khan, S. J., Abidi, S. N., Tian, Y., Skinner, A., Smith-Bolton, R. K. A rapid, gentle and scalable method for dissociation and fluorescent sorting of imaginal disc cells for mRNA sequencing. Fly (Austin). 10 (2), 73-80 (2016).
- Corrigan, L., et al. BMP-regulated exosomes from Drosophila male reproductive glands reprogram female behavior. Journal of Cell Biology. 206 (5), 671-688 (2014).
- Leiblich, A., et al. Bone morphogenetic protein- and mating-dependent secretory cell growth and migration in the Drosophila accessory gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19292-19297 (2012).
- Kubo, A., et al. Nutrient conditions sensed by the reproductive organ during development optimize male fecundity in Drosophila. Genes to Cells. 23 (7), 557-567 (2018).
- Immarigeon, C., Karch, F., Maeda, R. K. FACS-based isolation and RNA extraction of Secondary Cells from the Drosophila male Accessory Gland. bioRxiv. , 630335 (2019).
