Visualisering van de morfologie van de astrocyten met behulp van Lucifer geel Iontforesis
Summary
Astrocyten zijn morfologisch complexe cellen, geïllustreerd door hun meerdere processen en bossige gebieden. Om hun uitgebreide morfologie te analyseren, presenteren wij een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Lucifer gele Iontoforese in licht vast weefsel.
Abstract
Astrocyten zijn essentiële componenten van neurale circuits. Ze tegel het gehele centrale zenuwstelsel (CNS) en zijn betrokken bij een verscheidenheid van functies, waaronder de klaring van de neurotransmitter, Ion regulatie, synaptische modulatie, metabole ondersteuning voor neuronen, en de regulering van de bloedstroom. Astrocyten zijn complexe cellen met een Soma, verschillende belangrijke takken en tal van fijne processen die verschillende cellulaire elementen in de neuro pil contacteren. Om de morfologie van astrocyten te beoordelen, is het noodzakelijk om een betrouwbare en reproduceerbaar methode te hebben om hun structuur te visualiseren. We rapporteren een betrouwbaar protocol voor het uitvoeren van intracellulaire Iontoforese van astrocyten met behulp van fluorescerende Lucifer geel (LY) kleurstof in licht vaste hersenweefsel van volwassen muizen. Deze methode heeft verschillende functies die nuttig zijn om de morfologie van astrocyten te karakteriseren. Het maakt de driedimensionale reconstructie van individuele astrocyten mogelijk, wat nuttig is om morfologische analyses uit te voeren op verschillende aspecten van hun structuur. Immunohistochemie samen met LY iontforesis kan ook worden gebruikt om de interactie van astrocyten met verschillende componenten van het zenuwstelsel te begrijpen en om de expressie van eiwitten binnen de gelabelde astrocyten te evalueren. Dit protocol kan worden geïmplementeerd in een verscheidenheid van Muismodellen van CZS-aandoeningen om de morfologie van astrocyten grondig te onderzoeken met lichte microscopie. LY Iontoforese biedt een experimentele benadering om de astrocyten structuur te evalueren, vooral in de context van letsel of ziekte, waarbij deze cellen worden voorgesteld om significante morfologische veranderingen te ondergaan.
Introduction
Astrocyten zijn de meest voorkomende gliacellen in het centrale zenuwstelsel (CNS). Ze spelen rollen in ion homeostase, bloedstroom regulatie, Synapse vorming evenals eliminatie, en neurotransmitter opname1. Het brede scala aan astrocyten functies wordt weerspiegeld in hun complexe morfologische structuur2,3. Astrocyten bevatten verschillende primaire en secundaire takken die verdelen in duizenden fijnere vertakkingen en folders die rechtstreeks interageren met synapsen, dendrites, axonen, bloedvaten en andere gliacellen. De morfologie van de astrocyten varieert in verschillende hersengebieden, wat kan hint naar hun vermogen om hun functies differentieel te vervullen in neuronale circuits4. Bovendien is bekend dat astrocyten hun morfologie veranderen tijdens de ontwikkeling, tijdens fysiologische omstandigheden, en in meerdere ziektetoestanden3,5,6.
Een consistente, reproduceerbare methode is nodig om de complexiteit van de morfologie van de astrocyten nauwkeurig op te lossen. Van oudsher wordt immunohistochemie gebruikt om astrocyten te visualiseren met het gebruik van specifieke astrocyten of verrijkte eiwit markers. Echter, deze methoden onthullen het patroon van eiwit expressie in plaats van de structuur van de astrocyten. De veelgebruikte markers, zoals gliacellen fibrillair zuur eiwit (GFAP) en S100 calcium bindende proteïne β (S100β), drukken niet in het gehele celvolume uit en lossen dus geen volledige morfologie7op. Genetische benaderingen om fluorescerende eiwitten te uiten die alomtegenwoordig zijn in astrocyten (virale injecties of transgene muis reporter lijnen) kunnen de fijnere takken en het gehele grondgebied identificeren. Het is echter moeilijk om individuele astrocyten te differentiëren en analyses kunnen bevooroordeeld zijn door de astrocyten populatie die de specifieke promotor8target. Seriële sectie elektronenmicroscopie is gebruikt om een gedetailleerd beeld te onthullen van de interacties van astrocyten processen met synapsen. Vanwege de duizenden astrocyten processen die contact opnemen met synapsen, is het momenteel niet mogelijk om een hele cel te reconstrueren met deze techniek9, hoewel dit naar verwachting verandert met het gebruik van machine learning-benaderingen voor gegevensanalyse.
In dit rapport richten we ons op een procedure voor het karakteriseren van muis astrocyten met behulp van intracellulaire Iontoforese met Lucifer geel (LY) Dye, met behulp van de CA1 stratum radiatum als voorbeeld. De methode is gebaseerd op baanbrekend werk van Eric Bushong en Mark Ellisman10,11. Astrocyten van licht vaste hersen sneden worden geïdentificeerd door hun kenmerkende Soma-vorm en gevuld met LY. De cellen worden vervolgens met een confocale microscopie afgebeeld. We laten zien hoe sterk Iontoforese kan worden gebruikt om individuele astrocyten te reconstrueren en gedetailleerde morfologische analyses van hun processen en territorium uit te voeren. Ook kan deze methode worden toegepast in combinatie met immunohistochemie om ruimtelijke relaties en interacties tussen astrocyten en neuronen, andere gliacellen en hersen vasculatuur te identificeren. We beschouwen ly iontopforesis als een zeer geschikt hulpmiddel om de morfologie in verschillende hersengebieden en Muismodellen van gezonde of ziekte aandoeningen7,12,13te analyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De in dit artikel beschreven methode beschrijft een manier om de morfologie van astrocyten te visualiseren met behulp van intracellulaire iontforese van LY Dye in licht vaste hersen sneden. Er zijn verschillende kritische factoren die in dit protocol worden benadrukt en die bijdragen aan een succesvolle, zeer Iontoforese en morfologische reconstructie van de cellen. Een factor is de kwaliteit en reproduceerbaarheid van de beelden, die grotendeels wordt bepaald door de leeftijd van de muis en de uitkomst van de perfusie. …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken MS. Soto, Dr. Yu, en Dr. Octeau voor begeleiding, evenals opmerkingen over de tekst. Dit werk wordt ondersteund door NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neurosciences. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
