Visualiser la morphologie de l'astrocyte à l'aide de lucifer Yellow Iontophoresis

Summary

Les astrocytes sont des cellules morphologiquement complexes, illustrées par leurs multiples processus et territoires touffus. Pour analyser leur morphologie élaborée, nous présentons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis jaune intracellulaire de Lucifer dans le tissu légèrement fixé.

Abstract

Les astrocytes sont des composants essentiels des circuits neuronaux. Ils carirent l'ensemble du système nerveux central (SNC) et sont impliqués dans une variété de fonctions, qui comprennent le dégagement des neurotransmetteurs, la régulation des ions, la modulation synaptique, le soutien métabolique aux neurones, et la régulation du flux sanguin. Les astrocytes sont des cellules complexes qui ont un soma, plusieurs branches principales, et de nombreux processus fins qui contactent divers éléments cellulaires dans le neuropil. Afin d'évaluer la morphologie des astrocytes, il est nécessaire d'avoir une méthode fiable et reproductible pour visualiser leur structure. Nous rapportons un protocole fiable pour exécuter l'iontophoresis intracellulaire des astrocytes utilisant le colorant jaune fluorescent de Lucifer (LY) dans le tissu de cerveau légèrement fixé des souris adultes. Cette méthode a plusieurs caractéristiques qui sont utiles pour caractériser la morphologie des astrocytes. Il permet la reconstruction tridimensionnelle des astrocytes individuels, ce qui est utile pour effectuer des analyses morphologiques sur différents aspects de leur structure. L'immunohistochimie avec l'iontophoresis de LY peut également être employée pour comprendre l'interaction des astrocytes avec différents composants du système nerveux et pour évaluer l'expression des protéines dans les astrocytes étiquetés. Ce protocole peut être mis en œuvre dans une variété de modèles murins de troubles du SNC pour examiner rigoureusement la morphologie des astrocytes avec microscopie légère. LY iontophoresis fournit une approche expérimentale pour évaluer la structure des astrocytes, en particulier dans le contexte de blessures ou de maladies où ces cellules sont proposées pour subir des changements morphologiques importants.

Introduction

Les astrocytes sont les cellules gliales les plus abondantes du système nerveux central (SNC). Ils jouent des rôles dans l'homéostasie ionique, la régulation du flux sanguin, la formation de synapse ainsi que l'élimination, et l'élimination des neurotransmetteurs¹. La large gamme de fonctions d'astrocyte se reflète dans leur structure morphologique complexe^2,3. Les astrocytes contiennent plusieurs branches primaires et secondaires qui se divisent en milliers de branches et de folioles plus fines qui interagissent directement avec les synapses, les dendrites, les axones, les vaisseaux sa....

Protocol

Les expériences sur les animaux dans cette étude ont été effectuées conformément au National Institute of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals et ont été approuvées par le Comité de recherche sur les animaux du chancelier à l'Université de Californie à Los Angeles. Des souris adultes (6 à 8 semaines) de sexe mixte ont été utilisées dans toutes les expériences.

1. Préparation de la solution

1. Solution de liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF)
   1. Préparer une solution ACSF fraîche (135 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂, 14,7 mM NaHCO₃, 11 mM D-glucose, 1,25 mM Na_2....

Results

Les données rapportées dans cette étude proviennent de cellules de 7 à 12 cellules de 4 souris dans chaque expérience. Les données moyennes sont communiquées dans les panneaux de chiffres, le cas échéant.

Pour évaluer la morphologie des astrocytes, nous avons effectué une iontophoresis intracellulaire à l'aide de colorant LY pour remplir les astrocytes dans le radiatum de la strate CA1, qui est résumé à la figure 1. La figure 2 représente un astro.......

Discussion

La méthode décrite dans cet article décrit une manière de visualiser la morphologie d'astrocyte utilisant l'iontophoresis intracellulaire du colorant de LY dans les tranches légèrement fixes de cerveau. Il y a plusieurs facteurs critiques mis en évidence dans ce protocole qui contribuent à l'iontophoresis réussi de LY et à la reconstruction morphologique des cellules. Un facteur est la qualité et la reproductibilité des images, qui est déterminée en grande partie par l'âge de la souris et le résultat de la perfusion. Dan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate de formol tamponné à 10 %	Fisher	SF 100-20	Une alternative identique peut être utilisée
Filtres à seringue Acrodisc avec membrane Supor	Pall	4692	Une alternative identique peut être utilisée
Ag/AgCl granulés moulus	WPI	EP2	Une alternative similaire peut être utilisée
Alexa Fluor 546 chèvre anti-poulet IgG (H+L)	Thermo Scientific	A-11040	Une alternative similaire peut être utilisée
Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (H+L)	Thermo Scientific	A27040	Une alternative similaire peut être utilisée
Anticorps anti-aquaporine-4	Novus Biologicals	NBP1-87679	Une alternative similaire peut être utilisée
Anticorps anti GFAP	Abcam	ab4674	Une alternative similaire peut être utilisée
Pipettes en verre borosilicaté avec filament	World precision instruments	1B150F-4
C57BL/6NTac	souris Taconic Stock	B6	Une alternative similaire peut être utilisée
Chlorure	de calcium Sigma	21108	Une alternative identique peut être utilisée
Microscope confocal à balayage laser	Olympus	FV1000MPE	Une alternative similaire peut être utilisée
D-glucose	Sigma	G7528	Un une alternative peut être utilisée
Phosphate disodique	Sigma	255793	Une alternative identique peut être utilisée
Extracteur d’électrodes - Modèle P-97	Sutter	P-97	Une alternative similaire peut être utilisée
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01	Une alternative identique peut être utilisée
Héparine sodique injectable (1 000 USP par mL)	Sagent Pharmaceuticals	400-10	Une alternative identique peut être utilisée :
Imaris software (Version 7.6.5)	Bitplane Inc.		Une alternative similaire peut être utilisée
Isofluorane	Henry Schein Santé animale	29404	Une alternative identique peut être utilisée
Chlorhydrate de lidocaïne injectable (2 %)	Clipper	1050035	Une alternative identique peut être utilisée
Lucifer Yellow CH dilithium	salt Sigma	L0259
Lucifer Yellow CH dipotassium salt	Sigma	L0144
Chlorure	de magnésium Sigma	M8266	Une alternative identique peut être utilisée
Couvercle de microscope en verre	Thermo Scientific	24X60-1	Une alternative identique peut être utilisée
Lames de microscope	Fisher	12-544-2	Une alternative identique peut être utilisée
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000	Une alternative identique peut être utilisée
Objectif (40x)	Olympus	LUMPLFLN 40XW	Une alternative similaire peut être utilisée
Objectif (60x)	Olympus	PlanAPO 60X	Une alternative similaire peut être utilisée
Pastilles PBS, 100 mL	VWR	VWRVE404	Une alternative identique peut être utilisée
Micromanipulateur à pipette - Modèle ROE-200	Sutter	MP-285 / ROE-200 / MPC-200	Une alternative similaire peut être
utilisé Chlorure	de potassium Sigma	P3911	Une alternative identique peut être utilisée
Bicarbonate	de sodium Sigma	S5761	Une alternative identique peut être utilisée
Chlorure de sodium	Sigma	S5886	Une alternative identique peut être utilisée
Stimulateur- Modèle Omnical 2010	Instruments de précision mondiaux	Omnical 2010	Une alternative similaire peut être utilisée
Triton X 100	Sigma	T8787	Une alternative identique peut être utilisée
Vibratome- Modèle #3000	Pelco	100-S	Une alternative similaire peut être utilisée