Visualisere Astrocytt morfologi bruke Lucifer Yellow Iontoforese
Summary
Astrocytter er morfologisk komplekse celler, som er et eksempel på flere prosesser og buskete territorier. For å analysere deres forseggjort morfologi, presenterer vi en pålitelig protokoll for å utføre intracellulære Lucifer gul Iontoforese i lett fast vev.
Abstract
Astrocytter er essensielle komponenter av nevrale kretser. De flis hele sentralnervesystemet (CNS) og er involvert i en rekke funksjoner, som inkluderer signalstoffet klaring, ion regulering, Synaptic modulering, metabolsk støtte til neurons, og blodstrøm regulering. Astrocytter er komplekse celler som har en Soma, flere store grener, og mange fine prosesser som kontakter ulike cellulære elementer innenfor neuropil. For å vurdere morfologi av astrocytter, er det nødvendig å ha en pålitelig og reproduserbar metode for å visualisere deres struktur. Vi rapporterer en pålitelig protokoll for å utføre intracellulære Iontoforese av astrocytter ved hjelp av fluorescerende Lucifer gul (LY) fargestoff i lett fast hjernevev fra voksen mus. Denne metoden har flere funksjoner som er nyttige for å karakterisere astrocytt morfologi. Det gir mulighet for tredimensjonal rekonstruksjon av individuelle astrocytter, som er nyttig å utføre morfologiske analyser på ulike aspekter av deres struktur. Immunhistokjemi sammen med LY-Iontoforese kan også benyttes for å forstå samspillet mellom astrocytter med ulike komponenter i nervesystemet og for å evaluere uttrykket av proteiner innenfor de merkede astrocytter. Denne protokollen kan implementeres i en rekke musemodeller av CNS lidelser for å grundig undersøke astrocytt morfologi med lys mikroskopi. LY Iontoforese gir en eksperimentell tilnærming for å evaluere astrocytt struktur, spesielt i sammenheng med skade eller sykdom der disse cellene er foreslått å gjennomgå betydelige morfologiske endringer.
Introduction
Astrocytter er de mest tallrike gliacellene cellene i det sentrale nervesystemet (CNS). De spiller roller i ion homeostase, blodstrøm regulering, synapse formasjon, samt eliminering, og signalstoffet opptak1. Det store utvalget av astrocytt funksjoner gjenspeiles i deres komplekse morfologiske struktur2,3. Astrocytter inneholder flere primære og sekundære grener som deler seg inn i tusenvis av finere branchlets og brosjyrer som direkte samhandler med synapser, dendrites, axons, blodkar og andre gliacellene celler. Astrocytt morfologi varierer på tvers av ulike hjerneregioner, noe som kan hint på deres evne til å utføre sine funksjoner differensielt i neuronal kretser4. Videre er astrocytter kjent for å endre sin morfologi under utvikling, under fysiologiske forhold, og i flere sykdomstilstander3,5,6.
En konsistent, reproduserbar metode er nødvendig for å nøyaktig løse kompleksiteten av astrocytt morfologi. Tradisjonelt har immunhistokjemi blitt brukt til å visualisere astrocytter med bruk av astrocytt spesifikke eller astrocytt beriket protein markører. Disse metodene avslører imidlertid mønsteret av protein uttrykk i stedet for astrocytt struktur. De brukte markører, for eksempel gliacellene fibrillary surt protein (GFAP) og S100 kalsium bindende protein β (S100β), ikke uttrykker i hele celle volumet og dermed ikke løse komplett morfologi7. Genetiske tilnærminger for å uttrykke fluorescerende proteiner overalt i astrocytter (virale injeksjoner eller transgene mus reporter linjer) kan identifisere finere grener og generelle territorium. Det er imidlertid vanskelig å differensiere individuelle astrocytter, og analysene kan være partisk av den astrocytt befolkningen som er målrettet mot den spesifikke arrangøren8. Serial § elektron mikroskopi har blitt brukt til å avdekke et detaljert bilde av interaksjoner av astrocytt prosesser med synapser. På grunn av tusenvis av astrocytt prosesser som kontakter synapser, er det for øyeblikket ikke mulig å rekonstruere en hel celle med denne teknikken9, selv om dette er forventet å endre med bruk av maskin læringstilnærminger for dataanalyse.
I denne rapporten fokuserer vi på en prosedyre for å karakterisere muse astrocytter ved hjelp av intracellulære Iontoforese med Lucifer gul (LY) fargestoff, ved hjelp av CA1 stratum radiatum som et eksempel. Metoden er basert på banebrytende tidligere arbeid av Eric Bushong og Markus Ellisman10,11. Astrocytter fra lett faste hjerne skiver identifiseres av deres karakteristiske Soma form og fylt med LY. Cellene blir deretter avbildet med konfokalmikroskopi mikroskopi. Vi demonstrerer hvordan LY-Iontoforese kan brukes til å rekonstruere individuelle astrocytter og utføre detaljerte morfologiske analyser av deres prosesser og territorium. Denne metoden kan også brukes sammen med immunhistokjemi for å identifisere romlige forhold og interaksjoner mellom astrocytter og neurons, andre gliacellene celler, og hjernen blodkar. Vi anser ly Iontoforese å være et svært egnet verktøy for å analysere morfologi i ulike hjernen regioner og mus modeller av sunne eller sykdom forhold7,12,13.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden skissert i denne utredningen beskriver en måte å visualisere astrocytt morfologi ved hjelp av intracellulære Iontoforese av LY fargestoff i lett faste hjerne skiver. Det er flere kritiske faktorer uthevet i denne protokollen som bidrar til vellykket LY Iontoforese og morfologiske rekonstruksjon av cellene. En faktor er kvaliteten og reproduserbarhet av bildene, som bestemmes i stor grad av alder av musen og utfallet av. I denne studien brukte vi C57/BL6N mus 6 − 8 uker gammel. En vellykket blod (sterkt avhen…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker MS Soto, Dr. Yu, og Dr. Octeau for veiledning, samt kommentarer på teksten. Dette arbeidet er støttet av NS060677.
Materials
| 10% Buffered Formalin Phosphate | Fisher | SF 100-20 | An identical alternative can be used |
| Acrodisc Syringe Filters with Supor Membrane | Pall | 4692 | An identical alternative can be used |
| Ag/AgCl ground pellet | WPI | EP2 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 546 goat anti-chicken IgG (H+L) | Thermo Scientific | A-11040 | A similar alternative can be used |
| Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Scientific | A27040 | A similar alternative can be used |
| Anti Aquaporin-4 antibody | Novus Biologicals | NBP1-87679 | A similar alternative can be used |
| Anti GFAP antibody | Abcam | ab4674 | A similar alternative can be used |
| Borosilicate glass pipettes with filament | World precision instruments | 1B150F-4 | |
| C57BL/6NTac mice | Taconic Stock | B6 | A similar alternative can be used |
| Calcium Chloride | Sigma | 21108 | An identical alternative can be used |
| Confocal laser-scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | A similar alternative can be used |
| D-glucose | Sigma | G7528 | An identical alternative can be used |
| Disodium Phosphate | Sigma | 255793 | An identical alternative can be used |
| Electrode puller- Model P-97 | Sutter | P-97 | A similar alternative can be used |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | An identical alternative can be used |
| Heparin sodium injection (1,000 USP per mL) | Sagent Pharmaceuticals | 400-10 | An identical alternative can be used |
| Imaris software (Version 7.6.5) | Bitplane Inc. | A similar alternative can be used | |
| Isofluorane | Henry Schein Animal Health | 29404 | An identical alternative can be used |
| Lidocaine Hydrochloride Injectable (2%) | Clipper | 1050035 | An identical alternative can be used |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | |
| Lucifer Yellow CH dipotassium salt | Sigma | L0144 | |
| Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | An identical alternative can be used |
| Microscope Cover Glass | Thermo Scientific | 24X60-1 | An identical alternative can be used |
| Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | An identical alternative can be used |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | An identical alternative can be used |
| Objective lens (40x) | Olympus | LUMPLFLN 40XW | A similar alternative can be used |
| Objective lens (60x) | Olympus | PlanAPO 60X | A similar alternative can be used |
| PBS tablets, 100 mL | VWR | VWRVE404 | An identical alternative can be used |
| Pipette micromanipulator- Model ROE-200 | Sutter | MP-285 / ROE-200 / MPC-200 | A similar alternative can be used |
| Potassium Chloride | Sigma | P3911 | An identical alternative can be used |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | An identical alternative can be used |
| Sodium Chloride | Sigma | S5886 | An identical alternative can be used |
| Stimulator- Model Omnical 2010 | World precision instruments | Omnical 2010 | A similar alternative can be used |
| Triton X 100 | Sigma | T8787 | An identical alternative can be used |
| Vibratome- Model #3000 | Pelco | 100-S | A similar alternative can be used |
References
- Khakh, B. S., Sofroniew, M. V. Diversity of astrocyte functions and phenotypes in neural circuits. Nature Neuroscience. 18 (7), 942-952 (2015).
- Ben Haim, L., Rowitch, D. H. Functional diversity of astrocytes in neural circuit regulation. Nature Reviews Neuroscience. 18 (1), 31-41 (2017).
- Schiweck, J., Eickholt, B. J., Murk, K. Important Shapeshifter: Mechanisms Allowing Astrocytes to Respond to the Changing Nervous System During Development, Injury and Disease. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 261 (2018).
- Chai, H., et al. Neural Circuit-Specialized Astrocytes: Transcriptomic, Proteomic, Morphological, and Functional Evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Sun, D., Jakobs, T. C. Structural remodeling of astrocytes in the injured CNS. Neuroscientist. 18 (6), 567-588 (2012).
- Naskar, S., Chattarji, S. Stress Elicits Contrasting Effects on the Structure and Number of Astrocytes in the Amygdala versus Hippocampus. eNeuro. 6 (1), (2019).
- Sun, D., Lye-Barthel, M., Masland, R. H., Jakobs, T. C. The morphology and spatial arrangement of astrocytes in the optic nerve head of the mouse. Journal of Comparative Neurology. 516 (1), 1-19 (2009).
- Grosche, A., et al. Versatile and simple approach to determine astrocyte territories in mouse neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 8 (7), 69143 (2013).
- Kaynig, V., et al. Large-scale automatic reconstruction of neuronal processes from electron microscopy images. Medical Image Analysis. 22 (1), 77-88 (2015).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Wilhelmsson, U., et al. Redefining the concept of reactive astrocytes as cells that remain within their unique domains upon reaction to injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17513-17518 (2006).
- Williams, M. E., et al. Cadherin-9 regulates synapse-specific differentiation in the developing hippocampus. Neuron. 71 (4), 640-655 (2011).
- Ogata, K., Kosaka, T. Structural and quantitative analysis of astrocytes in the mouse hippocampus. Neurosciences. 113 (1), 221-233 (2002).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Hubbard, J. A., Hsu, M. S., Seldin, M. M., Binder, D. K. Expression of the Astrocyte Water Channel Aquaporin-4 in the Mouse Brain. ASN Neuro. 7 (5), (2015).
- Benediktsson, A. M., et al. Ballistic labeling and dynamic imaging of astrocytes in organotypic hippocampal slice cultures. Journal of Neuroscience Methods. 141 (1), 41-53 (2005).
- Fouquet, C., et al. Improving axial resolution in confocal microscopy with new high refractive index mounting media. PLoS ONE. 10 (3), 0121096 (2015).
- Luna, G., et al. Astrocyte structural reactivity and plasticity in models of retinal detachment. Experimental Eye Research. 150, 4-21 (2016).
- Octeau, J. C., et al. An Optical Neuron-Astrocyte Proximity Assay at Synaptic Distance Scales. Neuron. 98 (1), 49-66 (2018).
- Sosunov, A. A., et al. Phenotypic heterogeneity and plasticity of isocortical and hippocampal astrocytes in the human brain. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2285-2298 (2014).
- Park, Y. M., et al. Astrocyte Specificity and Coverage of hGFAP-CreERT2 [Tg(GFAP-Cre/ERT2)13Kdmc] Mouse Line in Various Brain Regions. Experimental Neurobiology. 27 (6), 508-525 (2018).
- Koeppen, J., et al. Functional Consequences of Synapse Remodeling Following Astrocyte-Specific Regulation of Ephrin-B1 in the Adult Hippocampus. Journal of Neuroscience. 38 (25), 5710-5726 (2018).
- Jefferis, G. S., Livet, J. Sparse and combinatorial neuron labelling. Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 101-110 (2012).
- Lanjakornsiripan, D., et al. Layer-specific morphological and molecular differences in neocortical astrocytes and their dependence on neuronal layers. Nature Communications. 9 (1), 1623 (2018).
