Visualizzazione e analisi del trasporto intracellulare di organelli e di altri carichi in Astrociti
Summary
Qui descriviamo un metodo in vitro di imaging dal vivo per visualizzare il trasporto intracellulare di organelli e il traffico di proteine della membrana plasmatica negli astrociti murini. Questo protocollo presenta anche una metodologia di analisi delle immagini per determinare gli itinerari e la cinetica nel trasporto merci.
Abstract
Gli astrociti sono tra i tipi di cellule più abbondanti nel cervello adulto, dove svolgono ruoli chiave in una molteplicità di funzioni. Come un giocatore centrale nell’omeostasi del cervello, gli astrociti forniscono ai neuroni metaboliti vitali e tamponamento di acqua extracellulare, ioni e glutammato. Componente integrante della sinapsi “tri-partite”, gli astrociti sono anche critici nella formazione, potatura, manutenzione e modulazione delle sinapsi. Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra di loro e con altre cellule gliali, neuroni, la vascolatura cerebrale e l’ambiente extracellulare attraverso una moltitudine di proteine della membrana specializzate che includono cellule molecole di aderenza, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Per supportare questo flusso dinamico, gli astrociti, come i neuroni, si basano su un trasporto intracellulare strettamente coordinato ed efficiente. A differenza dei neuroni, dove il traffico intracellulare è stato ampiamente delineato, il trasporto basato su microtubuli negli astrociti è stato meno studiato. Tuttavia, il traffico eso- ed endocitico delle proteine della membrana cellulare e del trasporto di organelli intracellulari orchestra la biologia normale degli astrociti, e questi processi sono spesso colpiti dalla malattia o in risposta a lesioni. Qui presentiamo un protocollo semplice alla coltura astrociti murini di alta qualità, per etichettare fluorescentmente proteine astrociti e organelli di interesse, e per registrare la loro dinamica di trasporto intracellulare utilizzando la microscopia con time-lapse. Dimostriamo anche come estrarre e quantificare i parametri di trasporto rilevanti dai film acquisiti utilizzando i plug-in disponibili per il software di analisi delle immagini (ad esempio, ImageJ/FIJI).
Introduction
Gli astrociti sono le cellule più abbondanti nel sistema nervoso centrale adulto, dove svolgono funzioni uniche di sviluppo e omeostatiche1. Gli astrociti modulano lo sviluppo sinaptico attraverso il contatto diretto con terminali pre e post-sinaptici come parte della sinapsi tri-partita, che contiene recettori del neurotrasmettitore, trasportatori e molecole di adesione cellulare che facilitano la formazione di sinapsi e comunicazione neurona-astrocito2. Inoltre, gli astrociti controllano attivamente la trasmissione sinaptica e prevengono l’eccitotossicità neuronale rimuovendo rapidamente i neurotrasmettitori eccitatori dalla fessura sinaptica, riciclando i neurotrasmettitori e partecipando alla potatura sinaptica3 , 4 DEL psu’ , 5 Del numero 3( , 6.Per consentire queste funzioni altamente interattive, gli astrociti comunicano tra loro, con altre cellule gliali, e con neuroni attraverso proteine di membrana specializzate, tra cui molecole di adesione cellulare, acquaporine, canali ionici, trasportatori di neurotrasmettitori e molecole di giunzione gap. Gli astrociti cambiano attivamente i livelli superficiali di queste proteine in risposta alle fluttuazioni nel loro ambiente intra- ed extracellulare7. Inoltre, i cambiamenti nei livelli e nella distribuzione dei mitocondri, delle goccioline lipidiche e degli organelli degradanti e di riciclaggio modulano l’approvvigionamento energetico, la disponibilità di metaboliti e i processi di compensazione cellulare essenziali per la funzione astrocite e sopravvivenza.
I cambiamenti dinamici nel traffico di proteine della membrana e degli organelli e nel posizionamento negli astrociti sono facilitati dalla funzione concertata di proteine motorie e adattatori che promuovono la motilità del carico8,9. Allo stesso modo, i livelli superficiali delle proteine della membrana sono modulati attraverso eventi di internalizzazione e riciclaggio10. Questi carichi vengono trasportati attraverso un’intricata rete di actin, microtubuli, e possibilmente filamenti intermedi tracce8. Studi basati sull’colorazione immunofluorescenza della proteina di legame finale 1 (EB1), che si accumula al crescente microtubulo più estremità, suggeriscono che nei fasci di astrocicli di microtubuli si irradiano dal perinucleo ed estendono il loro periferia11. Tuttavia, manca ancora un esame completo dell’organizzazione e della polarità dei microtubuli e di altri elementi citoscheletrici che utilizzano l’imaging a cellule vive. Mentre molti dei meccanismi alla base della dinamica degli organelli e delle proteine della membrana sono stati ampiamente studiati nei neuroni e in altri tipi di cellule, la motilità del carico negli astrociti è meno ben compresa. La maggior parte delle nostre attuali conoscenze sui cambiamenti nella distribuzione di proteine e organelli negli astrociti si basa sull’etichettatura tradizionale basata sugli anticorpi della preparazione fissa, che preclude un preciso esame spaziale e temporale delle dinamiche del carico7, 12.
Qui, descriviamo un metodo per etichettare proteine e organelli di membrana per l’imaging dal vivo in colture di astrociti primari ad alta purezza. Utilizzando questo protocollo, forniamo esempi in cui monitoriamo la localizzazione dinamica delle proteine della membrana con etichettatura delle proteine fluorescenti verdi (GFP) negli astrociti trafetti, tra cui la proteina di giunzione gap connexin 43 (Cx43-GFP) e l’amminoacido eccitatorio trasporto 1 (EAAT1-GFP). Descriviamo anche l’uso di una sonda acidotropica fluorescente per visualizzare organelli acidi e seguire le loro dinamiche di traffico in astrociti vivi. Infine, dimostriamo come analizzare i dati time-lapse per estrarre e valutare i parametri di trasporto per i singoli carichi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Qui, descriviamo un approccio sperimentale per esprimere, visualizzare e monitorare gli organelli etichettati fluorescentmente e le proteine della membrana di interesse utilizzando la microscopia video time-lapse in astrociclici corticali corticali di topo ad alta purezza. Illustreremo anche una metodologia per misurare la dinamica delle particelle. La visualizzazione diretta delle dinamiche di proteine e organelli negli astrociti primari fornisce un potente strumento per studiare la regolazione del trasporto intracellul…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DNL è stato supportato dalla University of North Carolina a Chapel Hill (UNC) School of Medicine come Simmons Scholar. TWR è stata supportata da UNC PREP Grant R25 GM089569. Il lavoro che utilizza l’UNC Neuroscience Center Microscopy Core Facility è stato sostenuto, in parte, dal finanziamento del NIH-NINDS Neuroscience Center Support Grant P3 NS0 NS0 45892 e del NIH-NICHD Intellectual and Developmental Disabilities Research Center Support Grant U54 HD079124.
Materials
| 2.5% Trypsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| Benchtop Centrifuge | Thermo Scientific | 75-203-637 | Sorvall ST8 Centrifuge |
| Cell Culture Grade Water | Gen Clone | 25-511 | |
| Cell Culture Microscope | Zeiss | WSN-AXIOVERT A1 | Vert.A1 inverted scope, Inverted tissue culture microscope with fluorescent capabilities |
| Cytosine Arabinoside | Sigma | C1768-100MG | (AraC) Dissolve lyophilized powder in sterile cell culture grade water to make a 10mM stock, aliquot and freeze for long term storage |
| DAPI | Sigma | D9542-5MG | Dissolve lyophilized powder in deionized water to a maximum concentration of 20 mg/ml, heat or sonicate as necessary. Use at 300 nM for counterstaining. |
| Dissecting Microscope | Zeiss | Stemi 305 | |
| Dissecting Scissors | F.S.T | 14558-09 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gen Clone | 25-500 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini | 100-106 | Heat-Inactivated |
| FIJI (Fiji is Just Image J) | NIH | Version 1.52i | |
| Fine Tip Tweezers | F.S.T | 11254-20 | Style #5 |
| Fluorescence light source | Excelitas | 012-63000 | X-Cite 120Q |
| GFAP antibody | Cell Signaling | 3670S | GFAP (GA5) mouse monoclonal antibody |
| Glass Bottom Dishes | Mattek corporation | P35G-1.5-14-C | 35 mm Dish | No. 1.5 Coverslip | 14 mm Glass Diameter | Uncoated |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11054-10 | Graefe Iris Forceps with curved tips |
| Green fluorescent dye that stains acidic compartments (late endosomes and lysosomes) | Life Technologies | L7526 | LysoTracker Green DND 26. Pre-dissolved in DMSOS to a 1mM stock solution. Dilute to the final working concentration in the growth medium or buffer of choice. |
| Hank's Balanced Salt Solution (10x) | Gibco | 14065-056 | Magnesium and calcium free |
| Imaging Media | Life Technologies | A14291DJ | Live Cell Imaging Solution |
| Inverted Confocal Microscope | Zeiss | LSM 780 | |
| KymoToolBox | https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox | ||
| Lipofection Enhancer Reagent | Life Technologies | 11514015 | Plus Reagent |
| Lipofection Reagent | Life Technologies | 15338100 | Lipofectamine LTX reagent |
| Orbital shaking incubator | New Brunswick Scientific | 8261-30-1008 | Innova 4230 , orbital shaking incubator with temperature and speed control |
| Penicillin/Strepomycin solution (100x) | Gen Clone | 25-512 | |
| Phosphate Buffered Saline (10x) | Gen Clone | 25-507x | |
| Poly-D-Lysine Hydrobromide | Sigma | P7405 | Dissolve in Tris buffer, pH 8.5, at 1mg/mL. Freeze for long term storage. Avoid cycles of freezing and thawing |
| Reduced serum medium | Gibco | 31985-062 | OPTI-MEM |
| Tissue Culture Flasks | Olympus Plastics | 25-209 | 75 cm^2. 100% angled neck access, 0.22um hydrophobic vented filter cap |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 51030285 | HERAcell VIOS 160i, tissue culture incubator with temperature, humidity, and CO2 control |
| Tris-Base | Sigma | T1503 | 8.402 g dissolved to one liter in water with 4.829 g Tris HCl to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Tris-HCl | Sigma | T3253 | 4.829 g dissolved to one liter in water with 8.402 g Tris Base to make 0.1 M Tris buffer, pH 8.5 |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200072 | |
| Vacuum-Driven Filter Systems | Olympus Plastics | 25-227 | 500 ml, PES membrane, 0.22 µm |
| Vannas scissors straight | Roboz | RS-5620 |
References
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends in Neurosciences. 22 (5), 208-215 (1999).
- Zuchero, J. B., Barres, B. A. Glia in mammalian development and disease. Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).
- Allaman, I., Bélanger, M., Magistretti, P. J. Astrocyte-neuron metabolic relationships: for better and for worse. Trends in Neurosciences. 34 (2), 76-87 (2011).
- Chung, W. S., Barres, B. A. The role of glial cells in synapse elimination. Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 438-445 (2012).
- Chung, W. S., Allen, N. J., Eroglu, C. Astrocytes Control Synapse Formation, Function, and Elimination. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (9), 020370 (2015).
- Shin, J. W., et al. Distribution of glutamate transporter GLAST in membranes of cultured astrocytes in the presence of glutamate transport substrates and ATP. Neurochemistry Research. 34 (10), 1758-1766 (2009).
- Potokar, M., et al. Cytoskeleton and vesicle mobility in astrocytes. Traffic. 8 (1), 12-20 (2007).
- Potokar, M., et al. Regulation of AQP4 surface expression via vesicle mobility in astrocytes. Glia. 61 (6), 917-928 (2013).
- Potokar, M., Lacovich, V., Chowdhury, H. H., Kreft, M., Zorec, R. Rab4 and Rab5 GTPase are required for directional mobility of endocytic vesicles in astrocytes. Glia. 60 (4), 594-604 (2012).
- Chiu, C. T., et al. HYS-32-Induced Microtubule Catastrophes in Rat Astrocytes Involves the PI3K-GSK3beta Signaling Pathway. PLoS ONE. 10 (5), 0126217 (2015).
- Basu, R., Bose, A., Thomas, D., Das Sarma, J. Microtubule-assisted altered trafficking of astrocytic gap junction protein connexin 43 is associated with depletion of connexin 47 during mouse hepatitis virus infection. Journal of Biological Chemistry. 292 (36), 14747-14763 (2017).
- Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visual Experiments. (71), e50079 (2013).
- McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. The Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
- Tedeschi, B., Barrett, J. N., Keane, R. W. Astrocytes produce interferon that enhances the expression of H-2 antigens on a subpopulation of brain cells. The Journal of Cell Biology. 102 (6), 2244-2253 (1986).
- Zala, D., et al. Vesicular glycolysis provides on-board energy for fast axonal transport. Cell. 152 (3), 479-491 (2013).
- . IJ KymoToolBox Available from: https://github.com/fabricecordelieres/IJ_KymoToolBox (2016)
