Ljusspot-baserat test för analys av Drosophila larval phototaxis

Summary

Detta protokoll introducerar en Light-spot-analys för att undersöka Drosophila larv phototactic beteende. I denna analys, en ljus fläck genereras som ljus stimulering, och processen för larv lätt undvikande registreras av en infraröd ljus-baserade Imaging system.

Abstract

De larver av Drosophila melanogaster visar uppenbara ljus-undvika beteende under födosök scenen. Drosophila larv phototaxis kan användas som en modell för att studera djur undvikande beteende. Detta protokoll introducerar en Light-spot analys för att undersöka larv foto taktik beteende. Den experimentella set-up innehåller två huvuddelar: en visuell stimulering system som genererar ljuspunkten, och en infraröd ljus-baserade bildsystem som registrerar processen för larv lätt undvikande. Denna analys möjliggör spårning av beteendet hos larv innan, under stöter på, och efter att ha lämnat ljuspunkten. Detaljer om larv rörelse inklusive retardation, paus, huvud gjutning, och svarvning kan fångas och analyseras med denna metod.

Introduction

De larver av Drosophila melanogaster visar uppenbara ljus-undvika beteende under födosök scenen. Drosophila larv phototaxis har varit under utredning, särskilt under de senaste 50 åren^{1,2,3,4,5,6,7 ,8}. Under de senaste åren, trots att 1) många nervceller medhjälp larv ljus undvikande har identifierats^{4,5,9,10,11,12} och 2) den kompletta connectome av larv visuella systemet vid upplösningen av synapser har fastställts¹³, de neurala mekanismerna bakom larv phototaxis fortfarande i stort sett oklart.

Ett antal beteendemässiga analyser har använts i att studera larv phototaxis. De kan i stort sett delas in i två klasser: en med rumsliga ljus lutningar och den andra som involverar tidsmässiga ljus lutningar. För rumsliga ljus gradientanalyser, är arenan uppdelad i lika många sektioner i ljus och mörker. Arenan kan delas upp i ljusa och mörka halvor^2,4 eller ljusa och mörka kvadranter^14,15, eller kan även separeras i omväxlande ljus och mörka rutor som på en schackbräde⁷. Vanligtvis, agar plattor används för rumslig ljus lutning assay, men rör som är indelade i alternativa ljusa och mörka sektioner kan också användas^10,14.

I äldre version av analyser, ljus belysning i allmänhet härstammar från under larverna. Men belysningen i nyare versioner härrör till stor del från ovan, eftersom larv ögon (t. ex. Bolwig organ som är känsliga för låg eller medelhög ljusintensiteter¹⁶) finns i det ogenomskinliga cephalofaryngeal skelettet med öppningar mot den övre fronten. Detta gör larverna mer känsliga för ljus från övre främre riktningar än underifrån bakom riktningar⁷. För temporala ljus gradientanalyser är ljusintensiteten rumsligt enhetlig i arenan, men intensiteten förändras över tid. Förutom temporala kvadrat våg ljus (dvs blinkande på/av eller stark/svagt ljus^3,7), temporally varierande ljus som överensstämmer med en linjär ramp i intensitet används också⁸ för att mäta känsligheten hos larver till en temporally växlande ljus stimulans.

En tredje typ av phototaxis assay är riktad ljus Scape navigation, som innebär belysning från ovan i en vinkel på 45 °⁷. Innan arbetet med Kane et al.⁷, endast grova parametrar såsom antalet larver i ljusa och mörka regioner, frekvensen av svarvning, och Trail längd beräknades i larv phototaxis assays. Eftersom arbetet i samma grupp, med analys av hög temporala upplösning video rekord för larv phototaxis, detaljerad dynamik larv rörelse under phototaxis (dvs., Instant hastigheter olika delar av larv kropp, rubrik riktning, vänd vinkel och motsvarande vinkelhastighet) har analyserats⁷. Sålunda, mer detaljerna av larv phototaxis beteende har blitt duglig till vara upptäckt. I dessa analyser testas larver i grupper så att grupp effekter inte utesluts.

Detta protokoll introducerar en Light-spot analys för utredning av larv beteendemässiga svar på individuell ljus stimulering. Den huvudsakliga experimentella uppsättningen består av ett visuellt stimuleringssystem och infrarött Ljusbaserat avbildningssystem. I det visuella stimuleringssystemet genererar en LED-ljuskälla en rund 2 cm-diameter ljuspunkt på en agarplatta, där larven testas. Ljusintensiteten kan justeras med en LED-drivrutin. Avbildnings systemet innehåller en infraröd kamera som fångar beteendet hos larven förutom 3 850 nm infraröda lysdioder som ger belysning för kameran. Kamerans lins täcks av ett 850 nm-pass filter för att blockera ljus från det visuella stimuleringssystemet från att komma in i kameran, medan det infraröda ljuset är tillåtet att komma in i kameran. Således förhindras störning av visuell stimulering på avbildning. I denna analys, de beteendemässiga detaljerna i de snabba Svaren av enskilda larver inom en period inklusive före, under, och efter att ha angett ljus registreras och analyseras.

Protocol

1. beredning av Drosophila -larver Förbered standard medium bestående av kokt majsmjöl (73 g), agar (5,6 g), sojabönor måltid (10 g), jäst (17,3 g), sirap (76 mL) och vatten (1000 mL). Höj alla flugor vid 25 ° c på standard medium i ett rum med en 12 h/12 h ljus/mörker cykel. 2. beredning av agarplattor Bered 1,0% agar lösning. Väg 3 g agar i en 500 mL bägare med en balans, tillsätt sedan 300 mL destillerat vatten. Placera ett folie pa…

Representative Results

Enligt protokollet, den Light spot analysen användes för att undersöka lätt undvikande beteende av tredje INSTAR larv som höjdes vid 25 ° c på standard medium i ett rum med en 12 h/12 h ljus/mörker cykel. En enda w1118 larv testades med hjälp av Light spot-analysen vid 25,5 ° c. Den genomsnittliga ljusintensiteten hos ljuspunkten som alstras av en 460 Nm-lysdiod var 0,59 μW/cm2. Hela processen med att gå in och ut ur ljuspunkten spelades in och analyserades med hjälp av SOS-pr…

Discussion

Detta protokoll presenterar Light spot-analysen för att testa förmågan hos Drosophila larver att fly från ljus. Denna analys möjliggör spårning av beteendet hos larver innan, under stöter på, och efter att ha lämnat en ljus fläck. Detaljer om larv rörelse kan fångas och analyseras. Ljus punkts analysen är mycket enkel och besitter en stark genomförbarhet. Kostnaden för hela enheten är inte hög. I experimentet används LED-ljus som ljuskälla. Den kan bytas ut mot ljuskällor med olika vågläng…

Materials

850 nm ± 3 nm infrared-light-generating LED	Thorlabs, USA	PM100A	Compatible Sensors: Photodiode and Thermal Optical Power Rangea: 100 pW to 200 W Available Sensor Wavelength Rangea: 185 nm-25 μm Display Refresh Rate: 20 Hz Bandwidtha: DC-100 kHz Photodiode Sensor Rangeb: 50 nA-5 mA Thermopile Sensor Rangeb: 1 mV-1 V
AC to DC converter	Thorlabs, USA	S120VC	Aperture Size: Ø9.5 mm Wavelength Range: 200-1100 nm Power Range: 50 nW-50 mW Detector Type: Si Photodiode (UV Extended) Linearity: ±0.5% Measurement Uncertaintyc: ±3% (440-980 nm), ±5% (280-439 nm), ±7% (200-279 nm, 981-1100 nm)
band-pass filter	Thorlabs, USA	DC2100	LED Current Range: 0-2 A LED Current Resolution: 1 mA LED Current Accuracy: ±20 mA LED Forward Voltage: 24 V Modulation Frequency Range: 0-100 kHz Sine Wave Modulation: Arbitrary
Collimated LED blue light	ELP, China	USBFHD01M	Max. Resolution: 1920X1080 F6.0 mm Sensor: 1/2.7" CMOS OV2710
Compact power meter console	Ocean Optics, USA	USB2000+(RAD)	Dimensions: 89.1 mm x 63.3 mm x 34.4 mm Weight: 190 g Detector: Sony ILX511B (2048-element linear silicon CCD array) Wavelength range: 200-850 nm Integration time: 1 ms – 65 seconds (20 seconds typical) Dynamic range: 8.5 x 10^7 (system); 1300:1 for a single acquisition Signal-to-noise ratio: 250:1 (full signal) Dark noise: 50 RMS counts Grating: 2 (250 – 800 nm) Slit: SLIT-50 Detector collection lens: L2 Order-sorting: OFLV-200-850 Optical resolution: ~2.0 nm FWHM Stray light: <0.05% at 600 nm; <0.10% at 435 nm Fiber optic connector: SMA 905 to 0.22 numerical aperture single-strand fiber
High-Power LED Driver	Minhongshi, China	MHS-48XY	Working voltage: DC12V Central wavelength: 850nm
high-resolution web camera	Thorlabs, USA	MWWHL4	Color: Warm White Correlated Color Temperature: 3000 K Test Current for Typical LED Power: 1000 mA Maximum Current (CW): 1000 mA Bandwidth (FWHM): N/A Electrical Power: 3000 mW Viewing Angle (Full Angle): 120˚ Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: >50 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupa: RG1 – Low Risk Group
LED Warm White	Mega-9, China	BP850/22K	Ø25.4(+0~-0.1) mm Bandwidth: 22±3nm Peak transmittance:80% Central wavelength: 850nm±3nm
Spectrometer	Noel Danjou	Amcap9.22	AMCap is a still and video capture application with advanced preview and recording features. It is a Desktop application designed for computers running Windows 7 SP1 or later. Most Video-for-Windowsand DirectShow-compatible devices are supported whether they are cheap webcams or advanced video capture cards.
Standard photodiode power sensor	Super Dragon, China	YGY-122000	Input: AC 100-240V~50/60Hz 0.8A Output: DC 12V 2A
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	M470L3-C1	Color: Blue Nominal Wavelengtha: 470 nm Bandwidth (FWHM): 25 nm Maximum Current (CW): 1000 mA Forward Voltage: 3.2 V Electrical Power (Max): 3200 mW Emitter Size: 1 mm x 1 mm Typical Lifetime: 100 000 h Operating Temperature (Non-Condensing): 0 to 40 °C Storage Temperature: -40 to 70 °C Risk Groupb: RG2 – Moderate Risk Group
Thermal power sensor	Thorlabs, USA	S401C	Wavelength range: 190 nm-20 μm Optical power range:10 μW-1 W(3 Wb) Input aperture size: Ø10 mm Active detector area: 10 mm x 10 mm Max optical power density: 500 W/cm2 (Avg.) Linearity: ±0.5%