用于初级肝细胞保存的散装滴滴 Vit;
Summary
本手稿描述了一种用于大量大鼠肝细胞的无冰冷冻保存方法，即原生细胞以低浓度的预孵化，并在大液滴中进行玻璃化。
Abstract
硝化是一种有前途的无冰替代品，适用于生物样品的经典慢冷冻（约1°C/min）冷冻保存。玻璃化需要极快的冷却速率，以实现水向玻璃相的过渡，同时避免有害的冰层形成。虽然使用冷冻保护剂（CPA）预孵育可以降低生物样品的关键冷却速率，但通常需要高浓度，通过保鲜法实现无冰冷冻保存。因此，由于CPA毒性，硝化受到阻碍，并仅限于可快速冷却的小样品。最近证明，这些固有的局限性可以通过散装滴滴的体积化来克服。使用这种新方法，细胞首先以低细胞内CPA浓度预育。利用快速渗透脱水，细胞内CPA直接集中在化化之前，无需完全平衡有毒CPA浓度。细胞脱水在流体装置中进行，并与连续高通量生成大尺寸液滴集成，这些液氮被玻璃化。这种无冰冷冻保存方法，与传统的慢冷冻冷冻保存相比，适用于大细胞数量，可增强肝细胞活力和代谢功能。本手稿详细介绍了成功散装滴滴滴化的方法。
Introduction
肝细胞冷冻保存后细胞活力和代谢功能丧失仍然是限制临床应用1、2、3的主要问题。肝细胞冷冻保存的基准方法是缓慢冷冻，通过用CPA（二甲基磺胺[DMSO]、葡萄糖和白蛋白）和随后控制速率冷冻（约1°C/min）预育肝细胞来执行低温4，5。尽管许多报告优化，CPA毒性加上有害的渗透不平衡在冻结和机械应力的结冰形成仍然是缓慢冻结6，7的基本缺点。
与缓慢冻结一个优势，因为水直接相向玻璃状态6完全避免了由于结冰造成的伤害。然而，要达到纯水的玻璃过渡温度（-137 °C），水必须以每秒100万摄氏度（即临界冷却速率）的速度冷却，以避免冰形成高于玻璃过渡温度8.添加 CPA 可以降低临界冷却速率，提高水溶液 9 的玻璃过渡温度。然而，即使注册会计师的浓度很高（例如，40%v/v DMSO 或更高），快速冷却速率仍需要快速冷却率才能成功进行硝化8、9。
所需的冷却速率和高 CPA 浓度导致两个主要的 Vitit 化缺点。首先，要实现快速冷却，样品必须具有较低的热质量。其次，为了达到高CPA浓度，同时避免渗透伤害，CPA必须缓慢引入，并在细胞内和细胞外隔间6之间完全平衡。这增加了细胞接触有毒注册会计师的时间。总之，这使得硝化成为一个繁琐的过程，一次只能有几个小样本（微升）。滴滴五硝化已被提出作为这些限制的潜在解决方案。通过将小细胞含量液滴（纳米升）暴露于液氮中，冷却率显著提高，从而使CPA浓度显著降低10、11、12，13，14.虽然多个高频滴产生喷嘴可能同时使用，但极小的滴大小将吞吐量限制在每分钟10微升，从而排除了大电池的有效玻璃化以每分钟毫升为单位的处理速率较高。
最近证明，这些固有的局限性的五化可以通过散装滴硝化15克服。这种新方法利用快速渗透脱水来浓缩细胞内CPA浓度为7.5%v/v乙二醇和DMSO，紧接在硝化之前，无需完全平衡有毒CPA浓度。细胞脱水在流体设备中通过肝细胞短暂接触高细胞外CPA浓度进行。虽然这种暴露会导致快速渗透脱水，但高CPA浓度太短，无法扩散到细胞中。脱水后，细胞立即被装在液氮直接玻璃化的液滴中。该方法消除了在细胞内完全接受高CPA浓度的需要，而高细胞外CPA浓度使大尺寸液滴的硝化成为可能化，从而以最小的CPA毒性产生高通量。
滴滴玻璃化提高保存后的直接和长期生存能力，以及原发性大鼠肝细胞的形态和代谢功能，而传统的冷冻保存慢冷冻15。本手稿提供了原发性大鼠肝细胞大体积滴滴化的方法细节。
Protocol
Representative Results
Discussion
通过缓慢冷冻对肝细胞的冷冻保存会导致生存能力和代谢功能降低。冷冻为经典冷冻保存提供了一个有前途的替代方案，因为完全避免冷冻损伤9。然而，需要与注册会计师进行预孵化，以降低临界冷却率8。因此，由于CPA毒性17，硝化受到阻碍，且样本量很小。为了克服这些限制，本手稿中提出的散装滴滴滴化方法被开发，以便在使用低预孵化…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
美国国家卫生研究院（R01DK096075、R01DK107875和R01DK114506）和美国国防部（国防部）（DoD RTRP W81XWH-17-1-0680）的资助得到了极大的认可。
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
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