Bulk dråbe vitrifikation for primær Hepatocyte konservering
Summary
Dette manuskript beskriver en isfri kryopreserverings metode for store mængder rotte hepatocytter, hvor primære celler er præ-inkuberet med kryoprotective midler i en lav koncentration og vitrificeret i store dråber.
Abstract
Forvitrifikation er et lovende isfrit alternativ til klassisk langsom frysning (ved ca. 1 °C/min) Kryopreservation af biologiske prøver. Forvitrifikation kræver ekstremt hurtige afkølingshastigheder for at opnå overgang af vand til glas fasen, samtidig med at skadelig isdannelse undgås. Selvom præ-inkubation med kryoprotective-midler (CPA) kan reducere den kritiske afkølingshastighed for biologiske prøver, er der generelt behov for høje koncentrationer for at muliggøre iskold kryopræservering ved vitrifikation. Som følge heraf hæmmes vitrifikation af CPA toksicitet og begrænset til små prøver, der kan afkøles hurtigt. Det blev for nylig påvist, at disse iboende begrænsninger kan overvindes ved bulk dråbe forvitrifikation. Ved hjælp af denne nye metode, celler er først præ-inkuberet med en lav intracellulær CPA koncentration. Ved at udnytte hurtig osmotisk dehydrering er den intracellulære CPA koncentreret direkte forud for forvitringen, uden at det er nødvendigt fuldt ud at ækvibrere toksiske CPA-koncentrationer. Den cellulære dehydrering udføres i en Fluidic enhed og integreret med kontinuerlig høj gennemløb generation af store størrelser dråber, der er vitrificeret i flydende nitrogen. Denne isfri kryopreserverings metode med minimal CPA-toksicitet er velegnet til store celle mængder og resulterer i øget hepatocyt levedygtighed og metabolisk funktion i forhold til klassisk langsom frysning Kryopreservation. Dette manuskript beskriver metoderne til vellykket bulk-dråbe vitrifikation i detaljer.
Introduction
Tab af cellelevedygtighed og metabolisk funktion efter Kryopreservation af hepatocytter er stadig et stort problem, der begrænser kliniske anvendelser1,2,3. Benchmarkmetoden for hepatocyt kryopræservering er langsom frysning, som udføres ved præ-inkupering af hepatocytter med CPA (dimethylsulfoxid [DMSO], glucose og albumin) og efterfølgende kontrollerede sats frysning (ved ca. 1 °c/min) til kryogene temperaturer4,5. Trods mange rapporterede optimeringer, er CPA toksicitet sammen med skadelige osmotiske ubalancer under frysning og mekanisk belastning af isdannelse fortsat grundlæggende ulemper ved langsom frysning6,7.
Forvitrifikation giver en fordel i forhold til langsom frysning i, at skaden på grund af isdannelse er helt undgås ved en direkte fase overgang af vand i glasset tilstand6. For at nå glasovergangstemperaturen i rent vand (-137 °C) skal vandet dog afkøles med en hastighed på 1.000.000 grader Celsius pr. sekund (dvs. den kritiske afkølingshastighed) for at undgå isdannelse over glasovergangstemperaturen8 . Tilsætning af CPAs kan sænke den kritiske afkølingshastighed og øge glasovergangstemperaturen af vandige opløsninger9. Men selv med høje CPA-koncentrationer (f. eks. 40% v/v DMSO eller højere) kræves der ikke desto mindre hurtige afkølingshastigheder for at opnå en vellykket forvitrifikation på8,9.
De påkrævede afkølingshastigheder og høje CPA-koncentrationer resulterer i to store ulemper ved forvitrifikation. For det første skal prøverne have en lav termisk masse for at muliggøre hurtig afkøling. For det andet, for at nå høje CPA koncentrationer og samtidig undgå osmotisk skade, CPAs skal langsomt indføres og fuldt ud ligevægt mellem intra-og ekstracellulære rum6. Dette øger eksponeringstid af celler til giftige CPAs. Sammen, dette gør forglasning en besværlig proces, der er begrænset til et par små størrelser prøver (mikroliter) ad gangen. Droplet vitrifikation er blevet foreslået som en potentiel løsning på disse begrænsninger. Ved at udsætte de minimale celle belastede dråber (nanoliere) til flydende nitrogen øges afkølingshastigheden betydeligt, hvilket derfor giver mulighed for en betydelig reduktion af CPA-koncentrationen10,11,12 ,13,14. Selv om flere højfrekvente dråber-genererende dyser potentielt kan anvendes samtidigt, begrænser den ekstremt lille Dråbestørrelse dataoverførselshastigheden til mikroliter pr. minut10, hvilket udelukker effektiv forvitning af store celle volumener med størrelser højere forarbejdnings hastigheder på rækkefølgen af milliliter pr. minut.
For nylig blev det påvist, at disse iboende begrænsninger af forvitrifikation kan overvindes ved bulk dråbe vitrifikation15. Denne nye metode udnytter hurtig osmotisk dehydrering til at koncentrere en intracellulær CPA koncentration af 7,5% v/v ethylenglycol og DMSO umiddelbart før forvitrifikation, eliminere behovet for fuld ligevægt af toksiske CPA koncentrationer. Den cellulære dehydrering udføres i en Fluidic enhed ved en kort eksponering af hepatocytterne til en høj ekstracellulær CPA koncentration. Selv om denne eksponering forårsager hurtig osmotisk dehydrering, det er for kort til den høje CPA koncentration at diffus ind i cellerne. Umiddelbart efter dehydrering indlæses cellerne i dråber, der er direkte vitrificeret i flydende nitrogen. Denne metode eliminerer behovet for fuld intracellulær optagelse af høje CPA-koncentrationer, mens den høje ekstrellulære CPA-koncentration muliggør forvitrifikation af store små dråber, hvilket resulterer i høje gennemløb med minimal CPA-toksicitet.
Dråbe vitrifikation forbedrer direkte og langsigtet levedygtighed efter konservering, samt morfologi og metabolisk funktion af primære rotte hepatocytter i forhold til klassisk Kryopreservation ved langsomt frysning15. Dette manuskript giver de metodologiske detaljer for bulk dråbe vitrifikation af primære rotte hepatocytter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryopreservation af hepatocytter ved langsom frysning resulterer i nedsat levedygtighed og metabolisk funktion. Vitrification tilbyder et lovende alternativ til klassisk Kryopreservation, da frostskader helt undgås9. Præinkubation med CPAs er dog påkrævet for at sænke den kritiske afkølingshastighed8. Derfor hæmmes forvitrifikation af CPA-toksicitet17 og begrænset til små stikprøve mængder. I bestræbelserne på at overvinde disse begræns…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering fra de amerikanske National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 og R01DK114506) og det amerikanske forsvarsministerium (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) er stærkt anerkendt.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
