Bulk Droplet Vitrification für primäre HepatozytenKonservierung
Summary
Dieses Manuskript beschreibt eine eisfreie Kryokonservierungsmethode für große Mengen von Rattenhepatozyten, bei der Primärzellen mit kryoprotektiven Mitteln in geringer Konzentration vorinkubiert und in großen Tröpfchen verglast werden.
Abstract
Die Vitrifizierung ist eine vielversprechende eisfreie Alternative zur klassischen Slow-Freezing (bei ca. 1 °C/min) Kryokonservierung biologischer Proben. Die Vitrifizierung erfordert extrem schnelle Kühlraten, um den Übergang von Wasser in die Glasphase zu erreichen und gleichzeitig eine schädliche Eisbildung zu vermeiden. Obwohl die Vorinkubation mit kryoprotektiveN (CPA) die kritische Abkühlrate biologischer Proben reduzieren kann, sind in der Regel hohe Konzentrationen erforderlich, um eine eisfreie Kryokonservierung durch Verglasung zu ermöglichen. Infolgedessen wird die Verglasung durch CPA-Toxizität behindert und auf kleine Proben beschränkt, die schnell gekühlt werden können. Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen durch die Verglasung von Tröpfchen überwunden werden können. Mit dieser neuartigen Methode werden Zellen zunächst mit einer niedrigen intrazellulären CPA-Konzentration vorinkubiert. Durch die Nutzung einer schnellen osmotischen Dehydrierung konzentriert sich das intrazelluläre CPA direkt vor der Vitrifizierung, ohne dass toxische CPA-Konzentrationen vollständig ausgeglichen werden müssen. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durchgeführt und mit kontinuierlicher hoher Durchsatzerzeugung von großen Tröpfchen integriert, die in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese eisfreie Kryokonservierungsmethode mit minimaler CPA-Toxizität eignet sich für große Zellmengen und führt zu einer erhöhten Hepatozytenlebensfähigkeit und Metabolisierungsfunktion im Vergleich zur klassischen langsam gefrierenden Kryokonservierung. Dieses Manuskript beschreibt die Methoden für eine erfolgreiche Bulk-Droplet-Verglasung im Detail.
Introduction
Verlust der Zelllebensfähigkeit und metabolische Funktion nach Kryokonservierung von Hepatozyten ist immer noch ein großes Problem, das klinische Anwendungen begrenzt1,2,3. Die Benchmark-Methode der Hepatozyten-Kryokonservierung ist das langsame Einfrieren, das durch Vorinkubation der Hepatozyten mit CPA (Dimethylsulfoxid [DMSO], Glucose und Albumin) und anschließender kontrollierter Rate gefriert (bei ca. 1 °C/min) kryogene Temperaturen4,5. Trotz vieler gemeldeter Optimierungen bleiben CPA-Toxizität zusammen mit schädlichen osmotischen Ungleichgewichten beim Einfrieren und mechanischer Belastung der Eisbildung grundlegende Nachteile des langsamen Einfrierens6,7.
Vitrifizierung bietet einen Vorteil gegenüber langsamem Einfrieren, da Verletzungen durch Eisbildung durch einen direkten Phasenübergang des Wassers in den Glaszustand6vollständig vermieden werden. Um jedoch die Glasübergangstemperatur von reinem Wasser (-137 °C) zu erreichen, muss das Wasser in einer Größenordnung von einer Million Grad Celsius pro Sekunde (d. h. der kritischen Abkühlrate) gekühlt werden, um eine Eisbildung über der Glasübergangstemperatur 8 zu vermeiden. . Die Zugabe von CPAs kann die kritische Kühlrate senken und die Glasübergangstemperatur wässriger Lösungenerhöhen 9. Doch auch bei hohen CPA-Konzentrationen (z.B. 40% v/v DMSO oder höher) sind für eine erfolgreiche Verglasung8,9dennoch schnelle Abkühlraten erforderlich.
Die erforderlichen Kühlraten und hohen CPA-Konzentrationen führen zu zwei großen Nachteilen der Verglasung. Um eine schnelle Kühlung zu ermöglichen, müssen die Proben zunächst eine geringe thermische Masse haben. Zweitens müssen CPAs langsam eingeführt und vollständig zwischen den intra- und extrazellulären Kompartimenten6ausgeglichen werden, um hohe CPA-Konzentrationen zu erreichen und gleichzeitig osmotische Verletzungen zu vermeiden. Dies erhöht die Expositionszeit von Zellen gegenüber toxischen CPAs. Zusammen macht dies die Verglasung zu einem umständlichen Prozess, der auf ein paar kleine Proben (Mikroliter) gleichzeitig beschränkt ist. Als mögliche Lösung für diese Beschränkungen wurde die Tröpfchenverglasung vorgeschlagen. Durch die Exposition von winzigen zellbeladenen Tröpfchen (Nanolitern) gegenüber flüssigem Stickstoff wird die Kühlrate deutlich erhöht, was eine erhebliche Reduktion der CPA-Konzentration10,11,12 ermöglicht. ,13,14. Obwohl mehrere hochfrequente Tröpfchen-erzeugungserzeugende Düsen potenziell gleichzeitig verwendet werden könnten, begrenzt die extrem kleine Tröpfchengröße den Durchsatz auf Mikroliter pro Minute10, was eine effiziente Verglasung großer Zellen verhindert. Volumen mit um Magnituden höheren Verarbeitungsraten in der Größenordnung von Millilitern pro Minute.
Kürzlich wurde gezeigt, dass diese inhärenten Einschränkungen der Vitrifizierung durch Bulk-Droplet-Vitrifizierung15überwunden werden können. Diese neuartige Methode nutzt eine schnelle osmotische Dehydrierung, um eine intrazelluläre CPA-Konzentration von 7,5 % v/v Ethylenglykol und DMSO unmittelbar vor der Vitrifizierung zu konzentrieren, wodurch die vollständige Ausgleichung toxischer CPA-Konzentrationen entfällt. Die zelluläre Dehydrierung wird in einem fluidischen Gerät durch eine kurze Exposition der Hepatozyten bei einer hohen extrazellulären CPA-Konzentration durchgeführt. Obwohl diese Exposition eine schnelle osmotische Dehydrierung verursacht, ist es zu kurz, als dass die hohe CPA-Konzentration in die Zellen diffundieren könnte. Unmittelbar nach der Dehydrierung werden die Zellen in Tröpfchen geladen, die direkt in flüssigem Stickstoff verglast sind. Diese Methode eliminiert die Notwendigkeit einer vollständigen intrazellulären Aufnahme hoher CPA-Konzentrationen, während die hohe extrazelluläre CPA-Konzentration die Verglasung großer Tröpfchen ermöglicht, was zu hohen Durchsatzvolumina mit minimaler CPA-Toxizität führt.
Tröpfchenverglasung verbessert die direkte und langfristige Lebensfähigkeit nach der Konservierung, sowie Morphologie und metabolische Funktion der primären Rattenhepatozyten im Vergleich zur klassischen Kryokonservierung durch langsames Einfrieren15. Dieses Manuskript enthält die methodischen Details für die Massentropfenverglasung von primären Rattenhepatozyten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kryokonservierung von Hepatozyten durch langsames Einfrieren führt zu verminderter Lebensfähigkeit und metabolischer Funktion. Vitrifikation bietet eine vielversprechende Alternative für die klassische Kryokonservierung, da Gefrierverletzungen vollständig vermieden werden9. Eine Vorinkubation mit CPAs ist jedoch erforderlich, um die kritische Kühlrate8zu senken. Folglich wird die Verglasung durch die CPA-Toxizität17 behindert und auf kleine…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung durch die US National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 und R01DK114506) und das US Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) wird sehr anerkannt.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
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