1 차 간세포 보존을 위한 대량 물방울 유리화
Summary
이 원고는 1 차 세포가 낮은 농도에서 저온 보호 제로 미리 배양되고 큰 물방울에서 유리화되는 다량의 쥐 간세포를 위한 얼음없는 동결 보존 방법을 기술합니다.
Abstract
Vitrification은 생물학적 시료의 고전 저감 동결(약 1°C/min)의 냉동 보존을 위한 유망한 얼음 없는 대안입니다. 유리화는 해로운 얼음 형성을 피하면서 유리 상으로 물의 전환을 달성하기 위해 매우 빠른 냉각 속도를 필요로한다. 냉동 보호제(CPA)를 사용한 사전 인큐베이션은 생물학적 시료의 중요한 냉각 속도를 감소시킬 수 있지만, 유리화에 의한 얼음 없는 냉동 보존을 위해서는 일반적으로 고농도가 필요합니다. 그 결과, 유리화는 CPA 독성에 의해 방해되고 빠르게 냉각될 수 있는 작은 샘플로 제한됩니다. 최근에는 이러한 고유의 한계가 대량 액적 유리화에 의해 극복될 수 있음을 입증되었다. 이 새로운 방법을 사용하여, 세포는 먼저 낮은 세포 내 CPA 농도로 미리 배양된다. 급속한 삼투성 탈수를 활용하는 세포내 CPA는 독성 CPA 농도를 완전히 평형화할 필요 없이 유리화 바로 전에 농축됩니다. 세포 탈수는 유체 장치에서 수행되며 액체 질소에서 유리화되는 대형 액적의 연속높은 처리량 생성과 통합됩니다. 최소한의 CPA 독성을 가진 이 얼음 없는 동결 보존 방법은 대량의 세포 양에 적합하며, 기존의 느린 동결 동결 보존에 비해 간세포 생존력과 대사 기능이 증가합니다. 이 원고는 성공적인 대량 물방울 유리화에 대한 방법을 자세히 설명합니다.
Introduction
간세포의 동결 보존 후 세포 생존력 및 대사 기능의 상실은 여전히 임상적용을제한하는 주요 문제이며1,2,3. 간세포 동결 보존의 벤치 마크 방법은 CPA (디메틸 설폭사이드 [DMSO], 포도당 및 알부민)로 간세포를 미리 배양하고 후속 제어 속도 동결 (약 1 °C / 분)에 수행되는 느린 동결입니다. 극저온4,5. 많은 보고된 최적화에도 불구하고, 얼음 형성의 동결 및 기계적 응력 동안 해로운 삼투성 불균형과 함께 CPA 독성은 느린 동결6,7의근본적인 단점으로 남아 있다.
Vitrification은 얼음 형성으로 인한 부상이 유리 상태로물의 직접 상 전환에 의해 완전히 회피되는 것을 통해 서두르는 이점을 제공한다6. 그러나 순수한 물(-137°C)의 유리 전이 온도에 도달하려면 유리 전이 온도 8 을 초과하는 얼음 형성을 피하기 위해 물은 초당 섭씨 100만 도(즉, 임계 냉각 속도)의 속도로 냉각되어야합니다. . CPA를 추가하면 임계 냉각 속도를 낮추고 수성 솔루션의 유리 전이 온도를 높일 수있습니다 9. 그러나 CPA 농도가 높은 경우에도(예: 40% v/v DMSO 이상) 빠른 냉각 속도는 그럼에도 불구하고 성공적인 유리화8,9에필요합니다.
필요한 냉각 속도와 높은 CPA 농도는 유리화의 두 가지 주요 단점을 초래합니다. 첫째, 빠른 냉각을 가능하게 하려면 시료의 열 질량이 낮아야 합니다. 둘째, 삼투성 손상을 피하면서 높은 CPA 농도에 도달하려면 CPA가 천천히 도입되어야하며 세포 내 구획과 세포 외 구획 사이에 완전히 균형을 이루어야합니다6. 이것은 유독한 CPA에 세포의 노출 시간을 증가시킵니다. 함께, 이것은 유리화한 번에 몇몇 작은 크기의 견본 (마이크로 리터)로 제한되는 성가신 프로세스를 만듭니다. 물방울 유리화는 이러한 제한에 대한 잠재적인 해결책으로서 제안되었다. 액체 질소에 최소 세포-라덴 방울(nanoliters)을 노출시킴으로써 냉각 속도가 현저히 증가하여 CPA농도10,11,12의 상당한 감소를 허용합니다. ,13,14. 다중 고주파 액적 발생 노즐을 동시에 사용할 수 있지만, 매우 작은 액적 크기는 분당마이크로리터10으로처리량을 제한하여 대형 셀의 효율적인 유리화를 배제합니다. 분당 밀리리터 의 순서에 더 높은 처리 속도볼륨.
최근에는 이러한 고유의 유리화한계를 벌크 액적유리화(15)에의해 극복할 수 있음을 입증했다. 이 새로운 방법은 신속한 삼투성 탈수를 활용하여 유리화 직전에 7.5% v/v 에틸렌 글리콜 및 DMSO의 세포내 CPA 농도를 집중하여 독성 CPA 농도의 완전한 평형화의 필요성을 제거합니다. 세포 탈수는 높은 세포외 CPA 농도에 간세포의 짧은 노출에 의해 유체 장치에서 수행된다. 이 노출은 급속한 삼투성 탈수를 일으키는 원인이 더라도, 세포로 확산하기 위하여 높은 CPA 사격량이 너무 짧습니다. 탈수 직후, 세포는 액체 질소에서 직접 유리화되는 액적에 로드됩니다. 이 방법은 높은 세포외 CPA 농도가 큰 액적의 유리화를 가능하게하여 CPA 독성을 최소화하면서 높은 처리량 볼륨을 생성하면서 높은 CPA 농도의 전체 세포 내 섭취의 필요성을 제거합니다.
물방울 유리화는 보존 후 직접 및 장기 생존력을 향상시키고, 1차 쥐 간세포의 형태및 대사 기능을 느리게 동결시킴으로써 고전적 냉동 보존에 비해향상된다. 이 원고는 1차 쥐 간세포의 대량 액적 유리화에 대한 방법론적 세부사항을 제공한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
간세포의 동결은 생존력과 신진 대사 기능을 감소시이어냅니다. Vitrification는 동결 부상이 완전히 피할 수 있기 때문에 고전적인 냉동 보존을위한 유망한 대안을 제공합니다9. 그러나, CPA를 가진 사전 인큐베이션은 임계 냉각 속도8을낮추기 위하여 요구됩니다. 따라서, 유리화는 CPA 독성17에 의해 방해되고 작은 샘플 부피에 제한된다. 이러한 ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
미국 국립 보건원(R01DK096075, R01DK107875 및 R01DK114506)과 미국 국방부(DoD RTRP W81XWH-17-1-0680)의 자금 지원이 크게 인정받고 있습니다.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
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