Förglasning i bulk för primär Hepatocytekonservering
Summary
Detta manuskript beskriver en isfri cryopreservations metod för stora mängder råtta hepatocyter där primära celler är förinkuberas med kryoprotektiva medel vid en låg koncentration och förglasat i stora droppar.
Abstract
Förglasning är ett lovande isfritt alternativ för klassisk långsam frysning (vid ca 1 ° c/min) kryopreservation av biologiska prover. Förglasning kräver extremt snabba kylningshastigheter för att uppnå en övergång av vatten till glas fasen och samtidigt undvika skadlig isbildning. Även om pre-inkubering med kryoprotektiva medel (CPA) kan minska den kritiska kylningen av biologiska prover, är höga koncentrationer i allmänhet behövs för att möjliggöra isfri kryopreservation genom förglasning. Som ett resultat hämmas vitrifiering av CPA toxicitet och begränsas till små prover som kan kylas snabbt. Det var nyligen visat att dessa inneboende begränsningar kan övervinnas genom bulk dropp vitrifiering. Med denna nya metod, celler är först förinkuberas med en låg intracellulär CPA koncentration. Hävstångseffekt snabb osmotisk uttorkning, den intracellulära CPA är koncentrerad direkt före förglasning, utan behov av att helt jämvikt giftiga CPA koncentrationer. Den cellulära dehydrering utförs i en fluidic enhet och integreras med kontinuerlig hög genomströmning generation av stora stora droppar som förglasat i flytande kväve. Denna ice-free frysförvaring metod med minimal CPA toxicitet är lämplig för stora cell mängder och resulterar i ökad hepatocyte lönsamhet och metabolisk funktion jämfört med klassisk långsam frysning frysförvaring. Detta manuskript beskriver metoderna för lyckad bulk dropp vitrifiering i detalj.
Introduction
Förlust av cellernas lönsamhet och metabolisk funktion efter kryopreservation av hepatocyter är fortfarande en viktig fråga som begränsar kliniska tillämpningar1,2,3. Benchmark-metoden för hepatocyte frysförvaring är långsam frysning, som utförs genom förinkuberande hepatocyterna med CPA (dimetylsulfoxid [DMSO], glukos och albumin) och efterföljande kontrollerad hastighet frysning (vid ca 1 ° c/min) till kryogena temperaturer4,5. Trots många rapporterade optimeringar, CPA toxicitet tillsammans med skadliga osmotiska obalanser under frysning och mekanisk stress av isbildning förbli grundläggande nackdelar med långsam frysning6,7.
Förglasning erbjuder en fördel över långsam frysning i att skada på grund av isbildning är helt undvikas genom en direkt fasövergång av vatten i glaset tillstånd6. Men för att nå glaset övergångstemperatur av rent vatten (-137 ° c), måste vattnet kylas med hastigheter i storleksordningen 1 000 000 grader Celsius per sekund (dvs. den kritiska kylningen) för att undvika isbildning över glaset övergångstemperatur8 . Tillägg av CPAs kan sänka den kritiska kylningshastigheten och öka glas övergångstemperaturen för vattenlösningar9. Men även med höga CPA koncentrationer (t. ex. 40% v/v DMSO eller högre) snabb kylning är ändå krävs för framgångsrik förglasning8,9.
De erforderliga kylnings-och höga CPA-koncentrationerna leder till två stora nackdelar med förglasning. Först, för att möjliggöra snabb kylning, proverna måste ha en låg termisk massa. För det andra, för att nå höga CPA-koncentrationer samtidigt som man undviker osmotisk skada, måste CPAs långsamt införas och helt jämställas mellan de intra-och extracellulära fack6. Detta ökar exponeringstiden för celler till giftiga CPAs. Tillsammans gör detta förglasning en besvärlig process som är begränsad till några små stora prover (mikroliter) i taget. Förglasning av DROPP har föreslagits som en potentiell lösning på dessa restriktioner. Genom att exponera miniscule cell-Laden droppar (nanoliters) till flytande kväve kylningen är betydligt högre, vilket följaktligen möjliggör en avsevärd minskning av CPA koncentrationen10,11,12 ,13,14. Även om flera munstycken som genererar högfrekventa droppar potentiellt kan användas samtidigt, begränsar den extremt lilla droppstorleken dataflödet till mikroliter per minut10, vilket utesluter effektiv förglasning av stora cell volymer med magnitud högre bearbetningshastigheter i storleksordningen milliliter per minut.
Nyligen visades att dessa inneboende begränsningar av förglasning kan övervinnas genom bulk dropp vitrifiering15. Denna nya metod utnyttjar snabb osmotisk uttorkning för att koncentrera en intracellulär CPA koncentration av 7,5% v/v etylenglykol och DMSO omedelbart före förglasning, vilket eliminerar behovet av full jämvikt av giftiga CPA koncentrationer. Den cellulära dehydrering utförs i en fluidic enhet genom en kort exponering av hepatocyterna till en hög extracellulär CPA koncentration. Även om denna exponering orsakar snabb osmotisk uttorkning, det är för kort för den höga CPA koncentrationen att sprida sig in i cellerna. Omedelbart efter uttorkning, cellerna lastas i droppar som är direkt förglasad i flytande kväve. Denna metod eliminerar behovet av fullt intracellulärt upptag av höga CPA koncentrationer medan den höga extracellulära CPA koncentrationen möjliggör vitrifiering av stora stora droppar, vilket resulterar i hög genomströmning volymer med minimal CPA toxicitet.
DROPP vitrifiering förbättrar direkt och långsiktig lönsamhet efter konservering, samt morfologi och metabolisk funktion av primära råtta hepatocyter jämfört med klassisk kryopreservation av långsam frysning15. Detta manuskript ger metodologiska Detaljer för bulk dropp vitrifiering av primära råtta hepatocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kryopreservation av hepatocyter genom långsam frysning resulterar i minskad lönsamhet och metabolisk funktion. Vitrification erbjuder ett lovande alternativ för Classic cryopreservation, som frysning skada är helt undvikas9. Före inkubering med CPAs krävs dock för att sänka den kritiska kylningshastigheten8. Följaktligen hindras förglasning av CPA-toxicitet17 och begränsad till små provvolymer. I arbetet med att övervinna dessa begränsn…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering från US National Institutes of Health (R01DK096075, R01DK107875 och R01DK114506) och US Department of Defense (DoD RTRP W81XWH-17-1-0680) är mycket erkänt.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
References
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
