En protokoll for 3D-visualisering av mikroskopiske vev strukturer ved hjelp av en røntgen spesifikk Fargemetode beregnet for X-ray beregnet tomografi presenteres.
Vi viser en laboratorie BAS ert metode som kombinerer røntgen microCT og nanoCT med en spesifikk røntgen flekk, som er rettet mot celle cytoplasma. Den beskrevne protokollen er enkel å bruke, rask og egnet for større bløt vevsprøver. Den presenterte metodikk muliggjør karakterisering av avgjørende vev strukturer i tre dimensjoner og er demonstrert på en hel mus nyre. Den multiscale tilnærmingen gjør det mulig å bilde hele musen nyre og støtter valg av ytterligere volumer av interesse, som er ervervet med høyere oppløsninger som spenner inn i nanometer området. Derved gjengis Soft-vev morfologi med et lignende detaljnivå som tilsvarende histologiske lys mikroskopi bilder. Dypere innsikt i 3D-konfigurasjonen av vev strukturer oppnås uten å hindre videre undersøkelser gjennom histologiske metoder.
Full karakterisering av bløt vevsprøver krever informasjon om 3D-vevet mikrostruktur. Den nåværende gullstandarden for prøve analyser av bløtvev er histopatologi. Vevet og cellulær morfologi av prøven utforskes i 2D i utvalgte områder av interesse (ROIs) ved hjelp av optiske mikroskopi1. Denne metoden har imidlertid flere ulemper. Utarbeidelsen av prøven er tidkrevende, komplisert, ødeleggende og utsatt for artefakter. De produserte mikroskopiske lysbildene gir bare 2D-informasjon parallelt med skjære planet. Ofte antall histologiske seksjoner, som er undersøkt, er begrenset på grunn av tidsbegrensninger2,3.
I de senere årene har området 3D-histologi utviklet seg. Her er virtuelle vev skiver fra alle ønsket romlig flyet tilgjengelig. Dette gjør det mulig for sporing av strukturer i hele prøven, noe som fører til en dypere forståelse av 3D vev arkitektur og strukturelle endringer knyttet til ulike patologi. Ulike metoder er utviklet for å oppnå generering av 3D-volumdata. De spenner fra seriell-delen basert tilnærminger, som bruker enten lys eller elektron mikroskopi4,5,6,7,8, til blokk-ansikt Imaging metoder, for eksempel episkopiske 3D Imaging eller blokk-Face skanning Electron mikroskopi7,8,9. Alle de nevnte metoder, men innebære enten skjæring eller ødelegge prøven helt, som ikke tillater for videre undersøkelser. Den oppnådde oppløsningen er svært avhengig av at skjære prosessen er utsatt for artefakter som beskrevet i konvensjonell histologi. Disse metodene lider også av innretting gjenstander.
3D X-ray Imaging teknikker som mikroskopiske og nanoscopic beregnet tomografi (microCT og nanoCT) Aspire å generere 3D høyoppløselig data uten ødeleggelse av vevsprøven. Så langt har den svake røntgen dempings kontrasten i bløtvev og den begrensede tilgangen til høye oppløsninger i et laboratoriemiljø svekket bruken for 3D-visualisering av mikroskopiske vevs strukturer. Nylige fremskritt mot laboratoriet-basert, høy oppløsning X-ray CT tillate oppløsninger godt under 1 μm10,11,12,13.
Mangelen på kontrast i bløtvev i konvensjonell demping-basert røntgenbilde er kompensert av farging agenter, som forbedrer X-ray demping kontrast. Farging agenter kjent fra andre Imaging teknikker som Osmium tetroxide (OsO4), jod kalium iodide (IKI) eller phosphotungstic acid (PTA) er ofte brukt14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Fargestoffer som tillater (i) spesifikk biologisk målretting, (II) homogen og fullstendig farging, (III) enkel håndtering, (IV) rask inntrengning av vevet uten å skape gjenstander som diffusjon ringer, (v) store og tette vevs flekker, og (vi) full kompatibilitet med histopatologi er nødvendig for å etablere røntgen CT som verktøy for 3D-visualisering av mikroskopiske vev strukturer. I dette arbeidet viser vi hvordan Soft-vevsprøver er forberedt for røntgen CT Imaging med en cytoplasma-spesifikk X-ray flekk basert på eosin som oppfyller kravene nevnt ovenfor26.
Multiscale Imaging tilnærming sikrer vurdering av fargekvalitet gjennom en oversikt microCT måling og valg av volumer av interesse (VOIs) for videre høyoppløselige undersøkelser. Fargekvaliteten analyseres med fokus på farge parametre som (i) fullstendighet, (II) utseende på diffusjon ringer, (III) kontrastforbedring, (IV) utseende av CT-artefakter som streker og (v) homogenitet. Laboratoriet-basert nanoCT oppsett, som bruker geometrisk forstørrelse å nå oppløsninger ned til 100 NM, visualiserer Soft-vev morfologi på (sub)-Cellular Level10,27. En komparativ analyse av nanoCT skiver med tilsvarende histologiske lys mikroskopi bilder bekrefter reproduksjon av vev arkitektur med lignende detaljer på et mikroskopisk nivå i 2D, slik at histopathological karakterisering av vevet Eksempel. Denne detaljerte videoen protokollen er ment å øke bevisstheten og å fremheve potensialet i denne metodikken som ikke-destruktiv 3D Soft-vev Imaging verktøyet er av interesse for et bredt vitenskapelig samfunn som zoologer, biologer og helse Fagfolk.
Foreløpig er eosin brukt som standard histologiske protokoll for å merke cellen cytoplasma. Den farging agent påføres som en 0,1% (w/v) vandig løsning på mikroskopiske skiver av bløtvev (vanligvis kuttet med en tykkelse på 2-10 μm)33. Anvendelsen av denne standardiserte histologiske protokollen til 3D vevsprøver som en hel mus nyre resulterer ikke i en demping kontrast forbedret CT bilde. På den ene siden, kan dette tilskrives den lave iboende demping egenskaper bløtvev for vanligvis brukt X-ray energier av laboratorie-baserte microCT systemer. Vanligvis er bløtvev sammensatt av hovedsakelig karbon, hydrogen, oksygen og nitrogen34, og derfor ikke resulterer i kontrast ekstrautstyr. På den annen side, den lave konsentrasjonen av eosin brukes til farging var begrensende faktor. Selv om en eosin molekyl har fire bromide atomer (høy Atom tall element brom med Z = 3534), følsomhet nivåer som kreves for røntgen CT Imaging ble ikke oppfylt.
For å overkomme denne utfordringen med lav dempings kontrast, ble det undersøkt flere konsentrasjoner av eosin. En begrensning er her den maksimale løselighet av eosin i vann, som er 30% (w/v) i en vandig løsning. Beste demping kontrast forsterkning innenfor bløtvevet ble observert med den høyeste eosin konsentrasjon, som var forventet i henhold til Lambert-Beer Law. Derfor ble den endelige farge protokollen utført med den høyeste konsentrasjonen.
Spørsmålet hvordan å forberede bløtvevet optimalt på et molekylnivå for farging prosedyren for å ytterligere forbedre kontrasten ekstrautstyr ble besvart av pH-justering. Her ble forsuring av prøven under fiksering eller før farging funnet å være avgjørende. Dette ble også vist av Hong et al.35. Jo høyere opphopning av farging agent i cellen cytoplasma av syre ble oppnådd gjennom forbedret ioniske interaksjoner, som var et resultat av protonation av aminosyre side kjeder av proteiner og peptider til stede i cellen cytoplasma. Et representativt resultat som fremhever kontrast forbedringen i forhold til et unstained eksempel, vises i figur 1a, b. Her, en strukturell oversikt over en hel mus nyre visualisere avgjørende anatomiske områder som cortex, forlengede, papilla og nyre bekkenet ble oppnådd.
Den presenterte farging protokollen er enkel å bruke og inneholder bare tre trinn. De nødvendige reagensene er lett tilgjengelige. Den generelle farging tid på 24 timer er rask for en hel-orgel farging, som muliggjør 3D-visualisering av Soft-vevsprøver (figur 1c, figur 2b og Figur 4b) i et laboratorium miljø på flere vekter ned til cellenivå. Det bør bemerkes at den generelle farging tid og volum av farging løsningen trengs kan be om noen tilpasninger avhengig av arten av prøven. Likevel er den eosin farge protokollen egnet for farging av hele orgel, som deretter muliggjør microCT avbildning av hele organer med høy oppløsning. Krymping gjenstander på grunn av løsemiddel etanol, som ble brukt til å holde prøven fuktig under microCT målinger, ble ikke observert. Ytterligere forberedelser trinn er nødvendig for nanoCT Imaging, som gjør det mulig for etterforskningen av mindre vev brikker Hentet fra den opprinnelige prøven. Med hensyn til fremtidige histopathological applikasjoner, vil oversikts skanninger gi verdifull innsikt i endrede anatomiske områder og strukturer, som tillater fastsettelse av ROIs som demonstrert i figur 2a. De kan bli studert i 3D av microCT (figur 1c og figur 2b) eller nanoCT (Figur 4b) og evaluert i 2D med histologi (Figur 3).
En annen styrke av protokollen er sett i full kompatibilitet med histopatologi med hensyn til H & E farge prosedyre. Anvendelsen av det eosin-basert farging fremgangsmåte å bulk eksemplar er ikke hindre fremme histologiske undersøkelser (skikkelsen 3), selv om det anvendt eosin konsentrasjonen er mange høyere sammenlignet med det histologiske flekk løsning. Den nanoCT skive med en virtuell tykkelse på ca 400 nm (Figur 3a) sammenligner allerede veldig godt med histologiske delen (Figur 3c), som var avledet fra den tilsvarende bløtvev prøven. Med tanke på den omtrentlige tykkelsen på en histologiske seksjon med 7-10 μm, vil genereringen av minste intensitet projeksjon skiver av nanoCT data (Figur 3b), som tilsvarer en virtuell tykkelse på ca 7 μm, gir en bedre sammenligning med histologiske delen (Figur 3c). Her er celle kjernene tydelig avslørt som ikke-demping området som eosin spesielt flekker proteiner og peptider i cellen cytoplasma33.
Anvendelsen av ytterligere motvirke farging med standard histologiske metoder er mulig, selv om rekkefølgen på farging i forhold til standard histologiske farging prosedyren ble reversert. Starter først med den utviklede eosin fargeprotokoll for CT, etterfulgt av Counter farging av de eosin-baserte histologiske seksjoner med hematoksylin, gir full kompatibilitet og resulterer i en høy kvalitet flekker som viser den forventede form av utseende. Cellekjerner-spesifikk farging med Mayer ‘ s Sure hematoksylin ble brukt til histologiske delen fremhever cellekjerner i lilla (Figur 3d). Anvendelsen av histologiske telleren farging er for tiden begrenset til H-stain. Andre standard histologiske mot farging som periodisk syre Schiff ‘ s base, gummitre van Gieson eller Gomori sølv må evalueres så vel som kompatibiliteten med immunohistological teknikker må testes.
Den eosin farge protokollen tillater (i) celle cytoplasma-spesifikk målretting, (II) homogen og fullstendig farging, (III) enkel implementering, (IV) rask inntrengning av vevet uten å skape gjenstander som diffusjon ringer, (v) farging av store og tette bløt vevsprøver og (vi) full kompatibilitet med histopatologi med hensyn til H & E-flekken. Disse kravene er viktig å tillate høy oppløsning X-ray CT visualisering av bløtvev ned til cellenivå. I kombinasjon med de nylig utviklede nanoCT enheter12,36,37, ikke-destruktiv generering av virtuelle histologiske skiver som er sammenlignbare i kontrast og oppløsning til konvensjonelle histologiske data gjengis mulig. Denne kombinerte tilnærmingen vil muliggjøre etablering av røntgen CT som et verdifullt verktøy for 3D-visualisering av mikroskopiske vev strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. enken Drecoll for histologiske diskusjoner og ekstremt hjelpsomme team ved Excillum AB, Sverige. Vi erkjenner finansiell støtte gjennom DFG Cluster of Excellence Munich Center for Advanced fotonikk (MAP) og DFG Gottfried Wilhelm Leibniz program. Videre har dette forskningsprosjektet fått støtte fra EU ‘ s Union Horizon 2020 forsknings-og innovasjonsprogram under Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement no. H2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |