Silenciando a faísca: Edição do genoma CRISPR/Cas9 em peixes fraca elétricos
Summary
Aqui, um protocolo é apresentado para produzir e traseira CRISPR / Cas9 genoma nocaute peixeelétrico. Descritos em detalhes são os requisitos necessários de biologia molecular, reprodução e criação para um ginásio e um mormyrid, e técnicas de injeção para produzir larvas DelF 0 induzidas por Cas9.
Abstract
A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Há um grau impressionante de convergência nesses fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum. Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que peixes elétricos fracos usam eletricidade para sentir seu entorno e se comunicar, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento, sistemas e circuitos de neurociência, fisiologia celular, ecologia, biologia evolutiva e comportamento. Mais recentemente, tem havido uma proliferação de recursos genômicos para peixes elétricos. O uso desses recursos já facilitou insights importantes no que diz respeito à conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas genômicas funcionais. Relatamos aqui um protocolo completo para a realização de mutagênese CRISPR/Cas9 que utiliza mecanismos de reparo de DNA endógenos em peixes fracamente elétricos. Demonstramos que este protocolo é igualmente eficaz tanto na espécie mormyrid Brienomyrus brachyistius e no gymnotiform Brachyhypopomus gauderio usando CRISPR/Cas9 para atingir indels e mutações pontuais na primeira exon do sódio canal gene scn4aa. Usando este protocolo, embriões de ambas as espécies foram obtidos e genotipados para confirmar que as mutações previstas no primeiro exon do canal de sódio scn4aa estavam presentes. O fenótipo de sucesso knock-out foi confirmado com gravações mostrando amplitudes reduzidas de descarga de órgãos elétricos quando comparadas a controles não injetados combinados com o tamanho.
Introduction
A eletrorecepção e a eletrogênese mudaram na história evolutiva dos vertebrados. Duas linhagens de peixes teleost, osteoglossiformes e siluriformes, evoluíram o electroreception em paralelo, e cinco linhagens de teleosts (gymnotiformes, mormyrids, e os Astros generacopus, Malapterurus, e Synodontis) evoluiu a eletrogênese em paralelo. Há um grau impressionante de convergência nestes fenótipos derivados independentemente, que compartilham uma arquitetura genética comum1,2,3.
Isto é talvez melhor exemplificado pelas numerosas características convergentes de gymnotiformes e mormyrids, dois folheados teleost ricos em espécies, que produzem e detectam campos elétricos fracos e são chamados de peixes fracamente elétricos. Nos 50 anos desde a descoberta de que os peixes fracamente elétricos usam eletricidade para sentir seu entorno e comunicar4, uma crescente comunidade de cientistas ganhou enormes insights sobre a evolução do desenvolvimento1,5 ,6, sistemas e circuitos neurociência7,8,9,10, fisiologia celular11,12, ecologia e energéticos13 ,14,15,16,17, comportamento18,19,e macroevolução3,20,21 .
Mais recentemente, houve uma proliferação de recursos genômicos, transcriptômicos e proteômicos para peixes elétricos1,22,23,24,25,26, 27,28. O uso desses recursos já produziu importantes insights sobre a conexão entre genótipo e fenótipo nessas espécies1,2,3,28,29 30de ano. Um grande obstáculo à integração de dados genômicos com dados phenotípicos de peixes elétricos fracos é a falta atual de ferramentas de genômica funcional31.
Uma dessas ferramentas é a recém-desenvolvida técnica Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic, emparelhada com a técnica de endonuclease Cas9 (CRISPR/Cas9, CRISPR). CRISPR/Cas9 é uma ferramenta de edição do genoma que entrou em uso generalizado em ambos osmodelos 32,33,34 e organismos não-modelo35,36,37 iguais. A tecnologia CRISPR/Cas9 progrediu a um ponto onde um laboratório capaz da biologia molecular básica possa facilmente gerar as pontas de prova gene-específicas chamadas RNAs curtos do guia (sgRNAs), a um baixo custo usando um método non-cloning38. Crispr tem vantagens sobre outras estratégias de nocaute / knockdown, como morpholinos39,40, ativador de transcrição como nucleases efetores efetos (TALENs), e nucleases de dedo de zinco (ZFNs), que são caros e demorado para gerar para cada gene alvo.
O sistema CRISPR/Cas9 funciona para criar nocautes genéticos, visando uma região específica do genoma, dirigida pela sequência sgRNA, e causando uma quebra dupla. A ruptura dupla encalhada é detectada pela célula e desencadeia mecanismos de reparo de DNA endógenos preferencialmente usando a via de junção final não-homólogo (NHEJ). Esta via é altamente propensa a erros: durante o processo de reparo, a molécula de DNA muitas vezes incorpora inserções ou exclusões (indels) no local de ruptura duplamente encalhado. Estes indels podem conduzir a uma perda de função devido a ambos (1) deslocamentos no frame aberto da leitura, (2) inserção de um codon prematuro do batente, ou (3) deslocamentos na estrutura preliminar crítica do produto do gene. Neste protocolo, utilizamos a edição CRISPR/Cas9 para atingir mutações de pontos em genes-alvo usando o NHEJ em espécies de peixes fracamente elétricas. Embora mais simples e mais eficiente do que outras técnicas, espera-se que este método de mutagênese resulte em uma série de gravidades phenotípicas em F0,que é atribuída ao mosaicismo genético41,42,43 ,44.
Seleção de organismos
Para fins de facilitar futuros estudos sobre a genômica comparativa de peixes elétricos fracos, uma espécie representativa tanto para gymnotiforms quanto para mormyrids para desenvolvimento de protocolo saqueou. Após discussões durante a reunião de 2016 sobre Peixes Elétricos em Montevidéu, Uruguai, houve consenso da comunidade para utilizar espécies que já poderiam ser criadas em laboratório e que tinham recursos genômicos disponíveis. O gymnotiform Brachyhypopomus gauderio e o mormyrid Brienomyrus brachyistius foram selecionados como espécies que se encaixam nesses critérios. Em ambas as espécies, pistas naturais para induzir e manter condições de reprodução são fáceis de imitar em cativeiro. B. gauderio, uma espécie de gymnotiformena da América do Sul, tem a vantagem de baixos requisitos de criação: os peixes podem ser mantidos em densidade relativamente alta em tanques relativamente pequenos (4 L). B. gauderio também tem rotatividade geracional rápida em condições cativas. Em condições de laboratório, B. gauderio pode se desenvolver de ovo para adulto em cerca de 4 meses.
B. brachyistius, uma espécie de peixe mormyrid da África Central Ocidental, se reproduz prontamente em cativeiro. B. brachyistius está prontamente disponível através do comércio do aquário, tem sido amplamente utilizado em muitos estudos, e agora tem uma série de recursos genômicos disponíveis. Seu ciclo de vida abrange 1 a 3 anos, dependendo das condições de laboratório. Os requisitos de criação são um pouco mais intensivos para esta espécie, exigindo tanques de tamanho moderado (50 a 100 L) devido à sua agressão durante a reprodução.
Laboratórios que estudam outras espécies de peixes elétricos devem ser capazes de adaptar facilmente este protocolo, enquanto a espécie pode ser criada, e embriões unicelulares podem ser coletados e criados na idade adulta. Habitação, criação de larvas e taxas de fertilização in vitro (FIV) provavelmente mudarão com outras espécies; no entanto, este protocolo pode ser usado como ponto de partida para tentativas de reprodução em outros peixes fracamente elétricos.
Um alvo ideal do gene para a prova do conceito: scn4aa
Peixes mormitridas e gymnotiformes fracamente elétricos geram campos elétricos (eletrogênese) descarregando um órgão especializado, chamado órgão elétrico. As descargas de órgãos elétricos (EODs) resultam da produção simultânea de potenciais de ação nas células de órgãos elétricos chamadas eletrocitos. EODs são detectados por uma matriz de eletroreceptores na pele para criar imagens elétricas de alta resolução do ambiente do peixe45. Os peixes fracamente elétricos também são capazes de detectar características das formas de onda EOD de suas coespecíficas18, bem como suas taxas de descarga46,permitindo que os EODs funcionem adicionalmente como um sinal de comunicação social análogo ao canto dos pássaros ou rã vocalizações47.
Um componente principal da geração potencial de ação nos eletrocitos de peixes mormiridos e gymnotiformes fracamente elétricos é o canal de sódio nav1.42. Teleosts não elétricos expressam duas cópias de genes paralogous, scn4aa e scn4ab,codificando para o canal de sódio nav1.430. Em ambas as linhagens de peixes gymnotiformes e mormiridas fracamente elétricas, a scn4aa evoluiu rapidamente e passou por inúmeras substituições de aminoácidos que afetam suas propriedades cinéticas48. Mais importante, scn4aa tornou-se compartimentado em ambas as linhagens para o órgão elétrico2,3. A expressão relativamente restrita de scn4aa ao órgão elétrico, bem como seu papel fundamental na geração de EODs, faz com que seja um alvo ideal para experimentos de nocaute CRISPR/Cas9, pois tem efeitos pleiotrópicos deletérios mínimos. Porque os peixes fraca elétricos começam a descarregar seus órgãos elétricos larval 6-8 dias após a fertilização (DPF), alvejar do scn4aa é serido idealmente para a phenotyping rápida que segue a microinjeção do embrião.
Protocol
Representative Results
Discussion
A riqueza phenotípica de peixes fracamente elétricos, juntamente com uma recente proliferação de recursos genômicos, motiva uma forte necessidade de ferramentas genômicas funcionais no modelo de peixe seleto fraco. Este sistema é particularmente atraente devido à evolução convergente de numerosas características phenotípicas em linhagens paralelas de peixes, que são facilmente mantidos em laboratório.
O protocolo aqui descrito demonstra a eficácia da técnica CRISPR/Cas9 em linh…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem os esforços heróicos de Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud e Hope Healey para ajudar com a criação de peixes, coleta de dados e desenvolvimento precoce do protocolo. Gostaríamos também de agradecer aos três revisores por suas sugestões ao manuscrito. Acreditamos que o produto final seja de melhor qualidade depois de abordar seus comentários. Este trabalho foi financiado pelo apoio da National Science Foundation #1644965 e #1455405 ao JRG, e da bolsa DG do Conselho de Pesquisa de Ciências Naturais e Engenharia para o VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
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