Uitschakeling van de vonk: CRISPR/Cas9 genoom bewerken in zwak elektrische vis
Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de productie en de achterste CRISPR/Cas9 genoom Knockout elektrische vissen. Gedetailleerd beschreven zijn de vereiste moleculaire biologie-, fok-en veeteelt vereisten voor zowel een gymnotitievorm als een mormyrid, en injectietechnieken om Cas9-geïnduceerde Indel F0 -larven te produceren.
Abstract
Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen. Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling, systemen en circuits neurowetenschappen, cellulaire fysiologie, ecologie, evolutionaire biologie, en gedrag. Meer recentelijk is er een wildgroei van genomische middelen voor elektrische vissen. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten vergemakkelijkt met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-instrumenten. We rapporteren hier een volledig protocol voor het uitvoeren van CRISPR/Cas9-mutagenese die gebruik maakt van endogene DNA-herstelmechanismen in zwak elektrische vissen. We tonen aan dat dit protocol even effectief is in zowel de mormyrid-soort Brienomyrus Brachyistius als de gymnotiform Brachyhypopomus GAUDERIO door crispr/Cas9 te gebruiken om indels en puntmutaties te richten in de eerste Exon van de natrium kanaal gen scn4aa. Met dit protocol werden embryo’s van beide soorten verkregen en gegenotypeerd om te bevestigen dat de voorspelde mutaties in de eerste Exon van het natrium kanaal scn4aa aanwezig waren. Het knock-out succes fenotype werd bevestigd met opnames met verminderde elektrische orgel ontlading amplituden in vergelijking met ongeinjecteerde grootte-gematchte controles.
Introduction
Electroreceptie en elektro genese zijn veranderd in de evolutionaire geschiedenis van gewervelde dieren. Twee lijnen van schip vis, Osteoglossiformes en Siluriformes, evolueerde electroreception parallel, en vijf lijnen van teleosts (Gymnotiformes, mormyrids, en de geslachten astroscopus, Malapterurus en Synodontis) evolueerde elektro genese parallel. Er is een opvallende mate van convergentie in deze onafhankelijk afgeleide fenotypes, die een gemeenschappelijke genetische architectuur delen1,2,3.
Dit wordt misschien het best geïllustreerd door de talrijke convergente kenmerken van gymnotiforms en mormyrids, twee soortenrijke schip-clades, die zwakke elektrische velden produceren en detecteren en zwak elektrische vissen worden genoemd. In de 50 jaar sinds de ontdekking dat zwak elektrische vissen elektriciteit gebruiken om hun omgeving te voelen en4te communiceren, heeft een groeiende Gemeenschap van wetenschappers enorme inzichten opgedaan in de evolutie van ontwikkeling1,5 ,6, systemen en circuits neurowetenschappen7,8,9,10, cellulaire fysiologie11,12, ecologie en energetica13 ,14,15,16,17, gedrag18,19en macro-evolutie3,20,21 .
Meer recentelijk is er een proliferatie van genomische, transcriptomische en proteomische middelen voor elektrische vissen1,22,23,24,25,26, 27,28. Het gebruik van deze middelen heeft al belangrijke inzichten opgeleverd met betrekking tot het verband tussen genotype en fenotype bij deze soorten1,2,3,28,29 ,30. Een belangrijk obstakel voor de integratie van genomics-gegevens met fenotypische gegevens van zwak-elektrische vissen is een aanwezig gebrek aan functionele genomics-tools31.
Een dergelijk hulpmiddel is de recent ontwikkelde geclusterd regelmatig Intergespreide korte palindroom herhalingen gecombineerd met Cas9 endonuclease (CRISPR/Cas9, CRISPR) techniek. Crispr/Cas9 is een genoom editing tool die wijdverbreid gebruik is ingevoerd in zowel model32,33,34 en niet-model organismen35,36,37 alike. CRISPR/Cas9 technologie heeft zich ontwikkeld tot een punt waar een laboratorium dat in staat is tot moleculaire biologie gemakkelijk genspecifieke sondes kan genereren, genaamd Short Guide RNAs (sgRNAs), tegen lage kosten met behulp van een niet-kloon methode38. Crispr heeft voordelen ten opzichte van andere knock-out/knockdown-strategieën, zoals morpholinos39,40, transcriptie Activator-achtige Effector nucleasen (Talens) en zink vinger nucleasen (zfns), die kostbaar zijn en tijdrovend om te genereren voor elk doel gen.
Het CRISPR/Cas9 systeem functioneert om genen knock-outs te maken door een specifieke regio van het genoom te targeten, geregisseerd door de sgRNA-reeks, en waardoor een dubbel-stranded pauze ontstaat. De dubbel-stranded breuk wordt gedetecteerd door de cel en activeert endogene DNA reparatie mechanismen bij voorkeur met behulp van de niet-Homologous end aansluiten (NHEJ) traject. Dit traject is zeer foutgevoelig: tijdens het herstelproces zal het DNA-molecuul vaak inserties of verwijderingen (indels) op de dubbel-streng break site opnemen. Deze indels kunnen resulteren in een verlies van functie door ofwel (1) verschuivingen in het open Lees frame, (2) inbrengen van een voortijdige stop codon, of (3) verschuivingen in de kritische primaire structuur van het genproduct. In dit Protocol maken we gebruik van CRISPR/Cas9 Editing om puntmutaties in doel genen te targeten met behulp van de NHEJ in zwak-elektrische vissoorten. Hoewel deze methode van mutagenese eenvoudiger en efficiënter is dan andere technieken, wordt naar verwachting een bereik van fenotypische ernstcategorieën in F0veroorzaakt, dat wordt toegeschreven aan genetisch mosaicisme41,42,43 ,44.
Selectie van organismen
Met het oog op de vergemakkelijking van toekomstige studies naar de vergelijkende genomica van zwak-elektrische vissen, moest een representatieve soort voor zowel gymnotie-en mormyrids voor protocol ontwikkeling worden geselecteerd. Na besprekingen tijdens de 2016 elektrische vissen bijeenkomst in Montevideo, Uruguay, was er consensus in de Gemeenschap om soorten te gebruiken die al in het laboratorium konden worden gefokt en die genomische middelen beschikbaar hadden. De gymnotiform Brachyhypopomus gauderio en de mormyrid Brienomyrus Brachyistius werden geselecteerd als soorten die aan deze criteria voldoen. Bij beide soorten zijn natuurlijke aanwijzingen voor het opwekken en handhaven van fokomstandigheden gemakkelijk in gevangenschap te nabootsen. B. gauderio, een gymnotie soort uit Zuid-Amerika, heeft het voordeel van lage veehouderij eisen: vis kan worden gehouden op relatief hoge dichtheid in relatief kleine (4 L) tanks. B. gauderio heeft ook een snelle generatie omzet onder interne omstandigheden. Onder laboratoriumomstandigheden kan B. gauderio in ongeveer 4 maanden van ei tot volwassen ontwikkelen.
B. Brachyistius, een soort van mormyrid vis uit West-Centraal Afrika, rassen gemakkelijk in gevangenschap. B. Brachyistius is direct beschikbaar via de aquarium handel, is op grote schaal gebruikt in vele studies, en heeft nu een aantal genomische middelen beschikbaar. Hun levenscyclus overspant 1 − 3 jaar, afhankelijk van de laboratoriumcondities. De behoeften van de veehouderij zijn iets intensiever voor deze soort, waarbij een matig grote tank (50 − 100 L) nodig is vanwege hun agressie tijdens de fokkerij.
Laboratoria die andere soorten elektrische vissen bestuderen, moeten dit protocol gemakkelijk kunnen aanpassen zolang de soorten kunnen worden gefokt, en eencellige embryo’s kunnen worden verzameld en gekweekt in de volwassenheid. De tarieven voor huisvesting, larvale veehouderij en in-vitro fertilisatie (IVF) zullen waarschijnlijk veranderen met andere soorten; Dit protocol kan echter worden gebruikt als uitgangspunt voor fokpogingen in andere zwak-elektrische vissen.
Een ideale genen target voor proof of concept: scn4aa
Zwak elektrische mormyrid en gymnotiform vis genereren elektrische velden (elektro genese) door het ontladen van een gespecialiseerd orgel, genaamd de elektrische orgel. Elektrische orgel lozingen (Eod’s) resulteren uit de gelijktijdige productie van actie potentialen in de elektrische orgel cellen genaamd elektro cyten. Eod’s worden gedetecteerd door een reeks electroreceptors in de huid om hoge-resolutie elektrische beelden van de omgeving van de vis te creëren45. Zwak elektrische vissen zijn ook in staat om kenmerken van hun condetails te detecteren ‘ EOD golfvormen18 en hun afvoer snelheden46, waardoor eod’s aanvullend kunnen functioneren als een sociaal communicatiesignaal analoog aan Bird Song of kikker vocaliisaties47.
Een belangrijk onderdeel van de actie potentiële generatie in de elektro cyten van zowel mormyrid als gymnotiform zwak elektrische vissen is de spanning-gated natrium kanaal NaV 1.42. Niet-elektrische teleosts uitdrukken twee paralogous gen-kopieën, scn4aa en scn4ab, codering voor de voltage-gated natrium kanaal NAV 1.430. In zowel gymnotiform en mormyrid zwak elektrische vissen kilometerstanden, scn4aa geëvolueerd snel en ondergaan talrijke aminozuursubstituties die invloed hebben op de kinetische eigenschappen48. Het allerbelangrijkste is dat scn4aa in beide lijn lijnen is compartimenaliseerd tot het elektrische orgel2,3. De relatief beperkte uitdrukking van scn4aa aan het elektrische orgel, evenals zijn sleutelrol in de generatie van eod’s, maakt het een ideaal doelwit voor crispr/Cas9 knock-out experimenten, omdat het minimale schadelijke pleiotrope effecten heeft. Omdat zwak elektrische vissen beginnen met het ontladen van hun larvale elektrische orgels 6 − 8 dagen na bevruchting (DPF), is targeting van scn4aa uitermate geschikt voor snelle fenotypen na embryo-micro injectie.
Protocol
Representative Results
Discussion
De fenotypische rijkdom van zwak elektrische vissen, samen met een recente proliferatie van genomics bronnen, motiveert een sterke behoefte aan functionele genomische gereedschappen in het zwak elektrische vismodel. Dit systeem is bijzonder aantrekkelijk vanwege de convergente evolutie van talrijke fenotypische eigenschappen in parallelle lijn afstanden van vissen, die gemakkelijk in het laboratorium worden bewaard.
Het hier beschreven protocol demonstreert de werkzaamheid van de CRISPR/Cas9 t…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs erkennen de heroïsche inspanningen van Monica Lucas, Katherine Shaw, Ryan Taylor, Jared Thompson, Nicole Robichaud, en Hope Healey voor hulp bij het verzamelen van vis, gegevensverzameling en vroege Protocol ontwikkeling. We willen ook de drie reviewers bedanken voor hun suggesties voor het manuscript. Wij geloven dat het eindproduct van betere kwaliteit is na het aanpakken van hun opmerkingen. Dit werk werd gefinancierd door de steun van de National Science Foundation #1644965 en #1455405 aan JRG, en de natuurwetenschappen en Engineering Research Council DG subsidie aan VLS.
Materials
| 20 mg/mL RNA grade Glycogen | Thermo Scientific | R0551 | |
| 50 bp DNA ladder | NEB | N3236L | |
| borosilicate glass capillary with filament | Sutter Instrument | BF100-58-10 | (O.D. 1.0mm, I.D. 0.58 mm, 10 cm length) |
| Cas9 protein with NLS; 1 mg/mL | PNA Biology | CP01 | |
| Dneasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 | |
| Eppendorf FemptoJet 4i Microinjector | Fisher Scientific | E5252000021 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Fisher Scientific | 10289651 | |
| Hamilton syringe | Fisher Scientific | 14-824-654 | referred to as "precision glass syringe" in the protocol |
| Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666 | referred to as "delicate task wipe" in the protocol |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AM1334 | |
| NEBuffer 3 | NEB | B7003S | used for in vitro cleavage assay |
| OneTaq DNA kit | NEB | M0480L | |
| Ovaprim | Syndel USA | https://www.syndel.com/ovaprim-ovammmlu010.html | referred to as "spawning agent" in the protocol |
| Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | referred to as "thermoplastic" in the protocol |
| Pipette puller | WPI | SU-P97 | sutter brand |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28106 | |
| Reusable needle- requires customization | Fisher Scientific | 7803-02 | Customize to 0.7 inches long; point style 4 and angle 25 |
| T4 DNA polymerase | NEB | M0203L | Use with the 10X NEB buffer that is included |
| Teflon coated tools | bonefolder.com | T-SPATULA4PIECE | referred to as "polytetrafluoroethene" in the protocol |
References
- Gallant, J. R., et al. Genomic basis for the convergent evolution of electric organs. Science. 344 (6191), 1522-1525 (2014).
- Zakon, H. H., Lu, Y., Zwickl, D. J., Hillis, D. M. Sodium channel genes and the evolution of diversity in communication signals of electric fishes: convergent molecular evolution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (10), 3675-3680 (2006).
- Arnegard, M. E., Zwickl, D. J., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system–twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 22172-22177 (2010).
- Lissmann, H. W. Continuous electrical signals from the tail of a fish. Gymnarchus niloticus Cuv. Nature. 167 (4240), 201-202 (1951).
- Cuellar, H., Kim, J. A., Unguez, G. A. Evidence of post-transcriptional regulation in the maintenance of a partial muscle phenotype by electrogenic cells of S. macrurus. FASEB Journal. 20 (14), 2540 (2006).
- Modrell, M. S., Baker, C. V. Evolution of electrosensory ampullary organs: conservation of Eya4 expression during lateral line development in jawed vertebrates. Evolution & Development. 14 (3), 277-285 (2012).
- Hopkins, C. D. Design features for electric communication. Journal of Experimental Biology. 202, 1217-1228 (1999).
- Kawasaki, M. Sensory hyperacuity in the jamming avoidance response of weakly electric fish. Current Opinion in Neurobiology. 7 (4), 473-479 (1997).
- Bell, C. C., Han, V. Z., Sugawara, Y., Grant, K. Synaptic plasticity in a cerebellum-like structure depends on temporal order. Nature. 387 (6630), 278-281 (1997).
- Heiligenberg, W. . Neural Nets in Electric Fish. , (1991).
- Ban, Y., Smith, B. E., Markham, M. R. A highly polarized excitable cell separates sodium channels from sodium-activated potassium channels by more than a millimeter. Journal of Neurophysiology. 114 (1), 520-530 (2015).
- Markham, M. R., Kaczmarek, L. K., Zakon, H. H. A sodium-activated potassium channel supports high-frequency firing and reduces energetic costs during rapid modulations of action potential amplitude. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1713-1723 (2013).
- Gavassa, S., Stoddard, P. K. Food restriction promotes signaling effort in response to social challenge in a short-lived electric fish. Hormones and Behavior. 62 (4), 381-388 (2012).
- Sinnett, P. M., Markham, M. R. Food deprivation reduces and leptin increases the amplitude of an active sensory and communication signal in a weakly electric fish. Hormones and Behavior. 71, 31-40 (2015).
- Salazar, V. L., Stoddard, P. K. Sex differences in energetic costs explain sexual dimorphism in the circadian rhythm modulation of the electrocommunication signal of the gymnotiform fish Brachyhypopomus pinnicaudatus. Journal of Experimental Biology. 211, 1012-1020 (2008).
- Lewis, J. E., Gilmour, K. M., Moorhead, M. J., Perry, S. F., Markham, M. R. Action potential energetics at the organismal level reveal a trade-off in efficiency at high firing rates. Journal of Neuroscience. 34 (1), 197-201 (2014).
- Salazar, V. L., Krahe, R., Lewis, J. E. The energetics of electric organ discharge generation in gymnotiform weakly electric fish. Journal of Experimental Biology. 216 (13), 2459-2468 (2013).
- Hopkins, C. D., Bass, A. Temporal coding of species recognition signals in an electric fish. Science. 212 (4490), 85-87 (1981).
- Arnegard, M. E., Jackson, B. S., Hopkins, C. D. Time-domain signal divergence and discrimination without receptor modification in sympatric morphs of electric fishes. The Journal of Experimental Biology. 209, 2182-2198 (2006).
- Sullivan, J. P., Lavoue, S., Arnegard, M. E., Hopkins, C. D. AFLPs resolve phylogeny and reveal mitochondrial introgression within a species flock of African electric fish (Mormyroidea: Teleostei). Evolution. 58 (4), 825-841 (2004).
- Crampton, W. G. R. Effects of anoxia on the distribution, respiratory strategies and electric signal diversity of gymnotiform fishes. Journal of Fish Biology. 53, 307-330 (1998).
- Pinch, M., Guth, R., Samanta, M. P., Chaidez, A., Unguez, G. A. The myogenic electric organ of Sternopygus macrurus: a non-contractile tissue with a skeletal muscle transcriptome. PeerJ. 4, 1828 (2016).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Waurick, I., Dieterich, C., Tiedemann, R. Cross-tissue and cross-species analysis of gene expression in skeletal muscle and electric organ of African weakly-electric fish (Teleostei; Mormyridae). BMC Genomics. 16, 668 (2015).
- Traeger, L. L., et al. Unique patterns of transcript and miRNA expression in the South American strong voltage electric eel (Electrophorus electricus). BMC Genomics. 16, 243 (2015).
- Salisbury, J. P., et al. The central nervous system transcriptome of the weakly electric brown ghost knifefish (Apteronotus leptorhynchus): de novo assembly, annotation, and proteomics validation. BMC Genomics. 16, 166 (2015).
- Lamanna, F., Kirschbaum, F., Tiedemann, R. De novo assembly and characterization of the skeletal muscle and electric organ transcriptomes of the African weakly electric fish Campylomormyrus compressirostris (Mormyridae, Teleostei). Molecular Ecology Resources. 14 (6), 1222-1230 (2014).
- Mate, S. E., Brown, K. J., Hoffman, E. P. Integrated genomics and proteomics of the Torpedo californica electric organ: concordance with the mammalian neuromuscular junction. Skeletal Muscle. 1 (1), 20 (2011).
- Swapna, I., et al. Electrostatic Tuning of a Potassium Channel in Electric Fish. bioRxiv. , (2017).
- Futuyma, . Evolution. Third Edition. , (2013).
- Thompson, A., Vo, D., Comfort, C., Zakon, H. H. Expression Evolution Facilitated the Convergent Neofunctionalization of a Sodium Channel Gene. Molecular Biology and Evolution. 31 (8), 1941-1955 (2014).
- Pitchers, W. R., Constantinou, S. J., Losilla, M., Gallant, J. R. Electric fish genomics: Progress, prospects, and new tools for neuroethology. Journal of Physiology Paris. , (2016).
- Liang, X., et al. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection. Journal of Biotechnology. 208, 44-53 (2015).
- Jung, C. J., et al. Efficient gene targeting in mouse zygotes mediated by CRISPR/Cas9-protein. Transgenic Research. 26 (2), 263-277 (2017).
- Liu, K., Petree, C., Requena, T., Varshney, P., Varshney, G. K. Expanding the CRISPR Toolbox in Zebrafish for Studying Development and Disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (13), (2019).
- Zu, Y., et al. Biallelic editing of a lamprey genome using the CRISPR/Cas9 system. Scientific Reports. 6, 23496 (2016).
- Crispo, M., et al. Efficient Generation of Myostatin Knock-Out Sheep Using CRISPR/Cas9 Technology and Microinjection into Zygotes. PLoS One. 10 (8), 0136690 (2015).
- Sun, D., Guo, Z., Liu, Y., Zhang, Y. Progress and Prospects of CRISPR/Cas Systems in Insects and Other Arthropods. Frontiers in Physiology. 8, 608 (2017).
- Gagnon, J. A., et al. Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs. PLoS One. 9 (5), 98186 (2014).
- Kok, F. O., et al. Reverse genetic screening reveals poor correlation between morpholino-induced and mutant phenotypes in zebrafish. Developmental Cell. 32 (1), 97-108 (2015).
- Morcos, P. A., Vincent, A. C., Moulton, J. D. Gene Editing Versus Morphants. Zebrafish. 12 (5), 319 (2015).
- Mehravar, M., Shirazi, A., Nazari, M., Banan, M. Mosaicism in CRISPR/Cas9-mediated genome editing. Biologie du développement. 445 (2), 156-162 (2019).
- Yen, S. T., et al. Somatic mosaicism and allele complexity induced by CRISPR/Cas9 RNA injections in mouse zygotes. Biologie du développement. 393 (1), 3-9 (2014).
- Singh, P., Schimenti, J. C., Bolcun-Filas, E. A Mouse Geneticist’s Practical Guide to CRISPR Applications. Génétique. 199 (1), 1-15 (2015).
- Mianné, J., et al. Analyzing the outcome of CRISPR-aided genome editing in embryos: screening, genotyping and quality control. Methods. 121-122, 68-76 (2017).
- van der Emde, G., Breed, M. D., Moore, J. . Encyclopedia of Animal Behavior. 1, 16-23 (2010).
- Carlson, B. A., Binder, M. D., Hirokawa, N., Windhorst, U., Hirsch, M. C. . Encyclopedia of Neuroscience. , 4039-4044 (2009).
- Hopkins, C. D. Neruoethology of Electric Communication. Annual Reviews of Neuroscience. 11, 497-535 (1988).
- Arnegard, M., Zwickl, D., Lu, Y., Zakon, H. H. Old gene duplication facilitates origin and diversification of an innovative communication system- twice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (51), 22172-22177 (2010).
- Doench, J. G., et al. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation. Nature Biotechnology. 32 (12), 1262-1267 (2014).
- Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Resarch. 46, 242-245 (2018).
- Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148 (2016).
- Kirschbaum, F. Environmental factors control the periodical reproduction of tropical electric fish. Experientia. 31 (10), 1159-1160 (1975).
- Iwama, G. K., McGeer, J. C., Pawluk, M. P. The effects of five fish anaesthetics on acid-base balance, hematocrit, cortisol and adrenaline in rainbow trout. Canadian Journal of Zoology. 67, 2065-2073 (1989).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). 4th ed. , (2000).
- Barrangou, R., Doudna, J. A. Applications of CRISPR technologies in research and beyond. Nature Biotechnology. 34 (9), 933-941 (2016).
- Adli, M. The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nature Communications. 9 (1), 1911 (2018).
- Maruyama, T., et al. Increasing the efficiency of precise genome editing with CRISPR-Cas9 by inhibition of nonhomologous end joining. Nature Biotechnology. 33 (5), 538-542 (2015).
- Liu, M., et al. Methodologies for Improving HDR Efficiency. Frontiers in Genetics. 9, 691 (2018).
- Kirschbaum, F., et al. Intragenus (Campylomormyrus) and intergenus hybrids in mormyrid fish: Physiological and histological investigations of the electric organ ontogeny. Journal of Physiology Paris. 110, 281-301 (2016).
- Jao, L. E., Wente, S. R., Chen, W. Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).
